CROMATOGRAFÍA

1. Introducción:

La cromatografía es una técnica utilizada para separar los componentes de una

mezcla. Puede utilizarse como técnica analítica para obtener información sobre
lo que está presente en una mezcla, o como técnica de purificación para separar
y recoger los componentes de una mezcla. La cromatografía es una técnica de
separación de sustancias para la caracterización de mezclas complejas,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes, en
dicha técnica los componentes de la muestra se distribuyen en dos fases de
diferente naturaleza, por medio de una variación de velocidad al ser arrastrados
por una fase móvil, líquida o gaseosa, a través de una fase estacionaria, sólida o
líquida. Las fases cromatográficas son la fase móvil y la estacionaria, la primera
es la que fluye a través de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los
compuestos de la mezcla. La fase estacionaria es en la cual están retenidos los
componentes de la muestra, y a través de la cual fluye la fase móvil arrastrando a
los mismos. La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas, separar los
componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados
posteriormente (etapa final de muchas síntesis). Por otro lado, la proporción de
los componentes de la mezcla finalidad analítica). En este caso, las cantidades de
material empleadas suelen ser muy pequeñas.

2. Clasificación:
Los métodos cromatográficos son de 2 tipos:

2.1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA:

Es un método de purificación versátil que se utiliza para separar los
compuestos en una solución. Una mezcla de solución es llevada por un
disolvente a través de una columna que contiene un adsorbente sólido,
llamado la fase estacionaria.Esta técnica es ampliamente aplicable, ya que
muchos adsorbentes diferentes (en fase normal, en fase reversa u otras)
pueden usarse con una amplia gama de solventes. Además, puede ser usada
con básculas con un rango desde los microgramos hasta los kilogramos.

2.1.1 CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS EN COLUMNA:

Las técnicas cromatográficas en columna se clasifican, a menudo,
indicando el estado físico de las dos fases utilizadas. Según esta
clasificación, se utilizan las siguientes expresiones:
2.1.1.1 Cromatografía de gases (GC)

 Es una técnica de separación en la

que la fase móvil es un gas. La
cromatografía de gases se lleva a
cabo siempre en columna.

2.1.1.2 Cromatografía de líquidos (LC)

 Es una técnica de separación en la que la fase móvil es un líquido.

La cromatografía de líquidos se puede realizar tanto en columna
como en plano.
 Nota: Hoy día, la cromatografía de líquidos en la que, normalmente se utilizan partículas muy pequeñas
y presiones de entrada relativamente altas, se suele denominar cromatografía de líquidos de alta eficacia
(o alta presión), y con el acrónimo HPLC.

2.1.1.3 Cromatografía de fluidos supercríticos

 (SFC) Es una técnica de separación en la que la fase móvil es un

fluido ligeramente por encima de su temperatura y presión críticas.

Nota: En general, los términos y definiciones utilizados en cromatografía de gases o líquidos, son
aplicables a la cromatografía de fluidos supercríticos.

2.2 CROMATOGRAFÍA PLANA:

Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina” o
“en capa delgada” porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y
rígido. Disposiciones experimentales para realizar una cromatografía en papel
descendente (izqda.)
2.2.1 CLASIFICACIÓN DE CROMATOGRAFÍA PLANA:

2.2.1.1 Cromatografia en capa fina:

 Es una técnica
cromatográfica que
utiliza una placa
inmersa verticalmente
en una fase móvil
(eluyente). Esta placa
cromatográfica
consiste en una fase
estacionaria polar (comúnmente se utiliza sílica gel) adherida a una
superficie sólida. La fase estacionaria es una capa uniforme de un
 absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio,
aluminio u otro soporte.

 La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente

mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u
otro soporte.

2.2.1.2 Cromatografia en papel

 Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar

análisis cualitativos, ya que, pese a no ser una técnica muy potente,
no requiere de ningún tipo de equipamiento.
 La cromatografía en papel de dos dimensiones consiste en
desarrollar el cromatograma en un disolvente, girar el papel 90º y
desarrollar el cromatograma en un disolvente diferente. Es útil para
separar mezclas complejas de compuestos similares.
 Actualmente, la cromatografía en papel se utiliza poco y ha sido
ampliamente reemplazada por la cromatografía en capa fina. No
obstante, todavía se utiliza como una poderosa herramienta
pedagógica.
3. Tipos:

Dependiendo de la tecnología utilizada, de la naturaleza del soporte (fase

estacionaria) y de la sustancia móvil (fase móvil), se pueden diferenciar los
siguientes tipos de cromatografía:

Cromatografía en papel:
La fase estacionaria está formada por una tira de papel de filtro. La muestra a
analizar se coloca en forma de gota sobre un extremo del papel. Luego se
sumerge la tira de papel en un recipiente donde se encuentra la fase móvil,
teniendo en cuenta que el extremo donde está colocada la muestra quede en la
parte de abajo del papel. La fase móvil asciende por capilaridad arrastrando
consigo la muestra y separando cada componente según su afinidad por la fase
estacionaria. Este tipo de cromatografía se emplea principalmente cuando cada
componente de la muestra tiene un color diferente, entonces se puede ver el
despliegue de colores sobre el papel para identificarlos.

Cromatografía en capa fina:

El funcionamiento de esta técnica es parecido al de la cromatografía en papel,
pero en este caso la fase estacionaria se construye depositando una resina polar
(casi siempre sílica gel), sobre una placa de vidrio o aluminio. Se coloca cierta
cantidad de la muestra a 1cm del borde inferior de la placa. Luego se sumerge
esta placa, teniendo en cuenta que el extremo que contiene la muestra debe
quedar hacia abajo, en un recipiente que contiene la fase móvil. La fase móvil
asciende por capilaridad separando los componentes de la muestra.
 Cromatografía en columna:
La fase estacionaria se coloca dentro de una columna que puede ser de vidrio
o acero inoxidable, entre otros materiales. La fase móvil puede ser líquida o
gaseosa. La muestra se coloca en el extremo superior de la columna y se deja
descender con la fase móvil utilizando la gravedad. De este modo, la
cromatografía en columna se puede clasificar como:
● Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es sólida y la móvil es
líquida.
● Cromatografía líquido-líquido. Ambas fases son líquidas.
● Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es líquida y la móvil es
gaseosa.
● Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil es
gaseosa.

Por otro lado, atendiendo al tipo de interacción del analito entre las fases
estacionarias y móviles, tenemos los siguientes tipos de cromatografía:

Cromatografía de adsorción:
En este tipo de cromatografía la fase estacionaria es un sólido, mientras que la
fase móvil es un líquido. La sustancia que forma la fase estacionaria puede ser
alúmina (Al2O3), sílice (SiO2) o resinas de intercambio iónico (matrices que
tienen sitios electrostáticamente activos, debido a lo que el analito se retiene en
ellas por interacción electrostática). La fase móvil puede estar formada por un
solvente o una mezcla de solventes. Algunos componentes de la mezcla serán
retenidos con mayor fuerza que otros, de esta forma ocurre la separación.

Cromatografía de partición:
Se da cuando la separación de los analitos de la mezcla se produce por diferencias
de sus solubilidades o polaridades entre la fase estacionaria y la fase móvil, siendo
ambas fases líquidos inmiscibles. La tecnología de las fases estacionarias ha
avanzado y ya existen variedades de líquidos embebidos en sólidos y resinas que
se utilizan con este fin. En este sentido existen dos tipos de cromatografía
dependiendo de la polaridad de la fase estacionaria y la fase móvil:
 En fase normal. La fase estacionaria es polar y la fase móvil es apolar.
 En fase reversa. La fase estacionaria es apolar y la fase móvil es polar.
 Cromatografía de intercambio iónico. Cuando la fase estacionaria es sólida
y posee grupos funcionales ionizables, es decir, con carga, que son capaces
de intercambiar su carga con el analito. Puede clasificarse en:
 Cromatografía de intercambio catiónico. La fase estacionaria contiene
grupos funcionales cargados negativamente, por lo que retiene cationes
(cargados positivamente).
● Cromatografía de intercambio aniónico. La fase estacionaria contiene

grupos funcionales cargados positivamente, por lo que retiene aniones

(cargados negativamente).
● Cromatografía de exclusión molecular. La fase estacionaria es un material

poroso a través del que eluyen los analitos, dependiendo de sus tamaños.
En este tipo de cromatografía no existe ningún tipo de interacción física o
química entre los analitos y la fase estacionaria. Los analitos de mayor
tamaño eluyen primero, es decir, no son retenidos en la fase estacionaria.
Mientras que los analitos de menor tamaño quedan atrapados en los poros
de la fase estacionaria y van saliendo de ella a medida que se pasa la fase
móvil (líquida).
Con el avance del conocimiento y la tecnología, las técnicas cromatográficas
fueron perfeccionándose y cada vez se han podido separar, identificar y
cuantificar de manera más exacta las sustancias presentes en una mezcla. Dos
ejemplos de cromatográficas avanzadas son la HPLC (Cromatografía Líquida de
Alta Eficacia) y la GC (Cromatografía Gaseosa).

● HPLC. Consiste en un tipo de cromatografía en columna, pero cuya fase

móvil se bombea a altas presiones a través de la fase estacionaria dentro

de la columna. La aplicación de una presión alta reduce la difusión de
los analitos por la fase estacionaria, logrando así mejores resultados,
además de disminuir los tiempos de trabajo.
● GC. La fase móvil es un gas y la fase estacionaria puede ser un sólido o

un líquido. La muestra se volatiliza antes de inyectarla en la columna

cromatográfica, pues debe ser gaseosa para que el gas portador la
transporte.

4. Procedimiento: Separación de aminoácidos por capa fina

Comprende de las siguientes etapas:

1: Se aplican muestras y patrones a la placa recubierta con gel de sílice (fase

estacionaria de la cromatografía)
2: La placa se introduce en la cubeta que contiene fase móvil (mezcla de
disolventes), se tapa y se espera a que la fase móvil ascienda; se detiene
pasando a la etapa 3.

3: Se saca la placa, se espera a que se evapore el disolvente y se procede al

revelado de los aminoácidos pulverizando con la disolución de ninhidrina.

4: Puedes pulsar en la cámara de fotos para capturar una imagen que se puede
copiar o guardar usando el menú contextual del navegador (La foto incluye
además el código del experimento, la fecha y la hora.
 5. Resultados:
● Se representa en una figura, los resultados obtenidos.
● Se indican los valores de distancia recorrida por cada uno de los
aminoácidos en una tabla y se calculan los correspondientes valores de Rf.
● Se indica la composición de la solución problema, justificando la
conclusión a la que se ha llegado.

Rf = Distancia recorrida por el aminoácido, Distancia recorrida por el

disolvente

CALCULAR: R, S

S1: R, = 0.22/6 = 0.03

S2: R, = 1.58/6 = 0.26

S3: R, = 2.49/6 = 0.415

S4: R, = 3.50/6 = 0.58

S5: R, = 3.70/6 = 0.61

P. R, = 59/6 = 9.83

Distancia recorrida por cada uno de los aminoácidos y cálculo del rf.

Aminoácidos Distancia recorrida Rf.

(cm)

Leucina 0.22 cm 0.03

Arginina 2.49 cm 0.415

Glicina 3.70 cm 0.61

Triptófano 3.50 cm 0.58

Valina 1.58 cm 0.26

6. Discusión y Comentarios:

Se debe justificar las diferencias en los valores de Rf para cada uno de los
aminoácidos, así como las formas de la mancha, tipo de color e intensidad. A
partir de la estructura química hay que relacionar el mayor o menor valor de
Rf con la mayor o menor solubilidad en las fases estacionaria y móvil.

7. Fundamentos de la separación:
La cromatografía comprende un conjunto de técnicas que tienen como
finalidad la separación de mezclas basándose en la diferente capacidad de
interacción de cada componente en otra sustancia.

8. Referencias Bibliográficas:

● Gismera García M.J. y María del Carmen Quintana Mani. Introducción a la

cromatografía líquida de alta resolución [En Línea]. Madrid: Editorial
Universidad Autónoma de Madrid, 2014 [consultado 05 May 2022].
Disponible en: https://elibro.net/es/ereader/uladech/53955?page=1
● García de Marina Bayo A. HPLC instrumental [En Línea]. Valencia:
Editorial de la Universidad Politécnica de Valencia, 2016 [consultado 05
May 2022]. Disponible en:
https://elibro.net/es/ereader/uladech/57402?page=1
● Polo Díez L.M. Fundamentos de cromatografía [En Línea]. Madrid: Dextra
Editorial, 2015 [consultado 05 May 2022]. Disponible en:
https://elibro.net/es/lc/uladech/titulos/131492.