Cromatografia

Método de análisis que permite la separación de gases o líquidos de una mezcla por
adsorción selectiva, produciendo manchas diferentemente coloreadas en el medio
adsorbente; está basado en la diferente velocidad con la que se mueve cada fluido a
través de una sustancia porosa.

¿Qué es la Cromatografía?

La cromatografía es una de las técnicas más usadas para separar los distintos componentes de
una mezcla para su posterior estudio. Este forma de separar componentes de una mezcla se
llama separación cromatográfica.

La cromatografía se aprovecha del movimiento de una mezcla por un soporte, por ejemplo,
papel o tela. Los elementos de la mezcla se mueven por el soporte a diferentes velocidades
separándose. Unos componentes se mueven por el soporte más fácilmente y otros se detienen,
esto hace que la mezcla se separe en bandas de diferentes componentes.

Aquí tienes un ejemplo:

Recuerda: Una mezcla está compuesta por dos o más componentes con propiedades diferentes.
La cromatografía se utiliza tanto para lograr la separación de los componentes de una
mezcla como para medir la proporción de cada elemento en la mezcla.

La ciencia que se encarga de estudiar los diferentes componentes de una sustancia es la química
analítica, por lo que la cromatografía es una técnica dentro de la química analítica.

El soporte puede ser papel, un gas, otro líquido, etc. Es un método físico de separación de
componentes. Luego veremos porqué se separan, las fases y los tipos de cromatografías.

Cromatografía Ejemplos

Un ejemplo, si sobre un mantel blanco se derrama un poco de vino tinto, transcurrido un tiempo
se observa que la mancha no es uniforme, sino que hay una zona con predominio de tonos azules
y otra en que la tonalidad es roja. Eso es porque se ha producido una separación cromatografía de
los pigmentos del vino.

Las tintas de los rotuladores son una mezcla compuesta por algún disolvente (parte líquida de la
mezcla) y diferentes pigmentos. Algunos colores, como el negro, suelen ser mezcla de dos o tres
pigmentos diferentes. Para separar estos pigmentos podemos realizar una cromatografía. Luego
veremos como.

Algunos de los ejemplos en los que se usa la cromatografía a diario son:

- Se suele usar para tomar pruebas de la escena de un crimen (el análisis de muestras de sangre o
de telas).

- Verificación de incendios provocados (identificación de las sustancias químicas responsables de

un fuego).

- Análisis de sangre después de la muerte o en vida para determinar los niveles de alcohol, drogas
o sustancias venenosas en el cuerpo.

- También se utiliza para determinar la composición de los alimentos.

- Para mirar los niveles de contaminación, por ejemplo, del agua o del aire.

- Para el estudio de mezclas complejas en cosas tales como alimentos, perfumes, petroquímica, y
producción farmacéutica.

- También puede ser fundamental para salvar millones de vidas. El mortal virus del Ébola, que se
ha cobrado más de 5.000 vidas desde su aparición a finales del año pasado, ha causado pánico en
los medios y en los países de Sierra Leona, Guinea y Liberia, en los que se ha limitado en gran
medida. A medida que los científicos tratan de combatir la enfermedad, la cromatografía se ha
revelado como muy útil para determinar qué anticuerpos son más eficaces en la neutralización de
Ébola.

¿Por qué se separan los componentes?

Dejamos que se mueva la mezcla por un soporte y los componentes se separan por que se
mueven a diferentes velocidades debido a las diferentes fuerzas de adsorciónque ejerce el
soporte sobre cada elemento, así de fácil.

Si, si, no nos hemos equivocado es adsorción, que puede confundirse con absorción pero no es lo
mismo. Vamos a explicarlo.

La absorción es cuando una sustancia se introduce en la estructura de otra. Ejemplo: una esponja
absorbe agua, entonces si cortamos la esponja en pedazos vamos a encontraragua en todas partes
de la estructura de la esponja

La adsorción es un fenómeno superficial, la sustancia adsorbida no se introduce en el volumen del

cuerpo, sino solo se adhiere a su superficie.

¿Queda claro la diferencia? Pues ahora que ya sabemos lo que es la adsorción. Veamos otra
definición de cromatografía química:
 La cromatografía química es una separación física de los componentes de una mezcla basado en
la adsorción selectiva de los componentes de la mezcla al moverse por un soporte.

Imaginemos el rotulador anterior, si pintamos sobre una tira de papel de filtro o secante con el
rotulador un poco más arriba de la base de la tira de papel (el papel será el soporte) y ahora lo
metemos en un recipiente con alcohol en la base del recipiente, el alcohol moja la base de la tira
de papel, asciende por las tiras de papel y al llegar a la tinta del rotulador que pintamos, disuelve
la tinta y sigue subiendo hasta provocar la separación de los pigmentos.

Esto se produce por las distintas velocidades a las que se mueven los pigmentos por el papel
cuando se mojan con el alcohol y se mueven. Abajo hay un video con ejemplo ya realizados para
que los puedas ver.

Como vemos hay una fase fija que será la colocación de la mezcla en el papel y otra móvil que
será la subida del alcohol por el papel. La fase fija se hace con papel (sólido) y la móvil se hace con
un líquido, el alcohol. Más adelante explicaremos las fases cromatografías. Aquí tienes una imagen
del ejemplo de la tinta del rotulador.

Fases de la Cromatografía

Las cromatografías se hacen en dos fases. Una estática y otra móvil.

En la fase estática o estacionaria, la mezcla se coloca sobre un soporte fijo, por ejemplo papel.

En esta fase tenemos ya la mezcla sobre un soporte, en nuestro ejemplo un papel.

En la fase móvil se hace mover otra sustancia sobre la mezcla que ya está sobre el soporte de la
fase estática, por ejemplo un líquido que se mueve por el papel con la mezcla. En la fase móvil
empezará el proceso de separación de los componentes de la mezcla al moverse a distintas
velocidades por el líquido los distintos componentes de la mezcla sobre el papel.

Tipos de Cromatografia

Aunque hay muchas y variadas técnicas cromatográficas, el objetivo de todas es separar las
sustancias que forman una mezcla y enviarlas secuencialmente a un detector para que las
determine y cuantifique.

Todas se basan en el mismo fenómeno: permitir que las sustancias que forman una mezcla
entren en contacto con dos fases (un líquido y un gas, un sólido y un líquido, etc.). Una de las fases
es estática (no se mueve) y tenderá a retener las sustancias en mayor o menor grado; la otra, fase
móvil, tenderá a arrastrarlas. Cada sustancia química tiene distinta tendencia a ser retenida y a ser
arrastrada.

Dependiendo de la naturaleza de la fase estática y de la fase móvil se pueden distinguir distintos

tipos de cromatografía

a) Cromatografía sólido-líquido: La fase estática o estacionaria es un sólido y la móvil un líquido.

b) Cromatografía líquido-líquido: La fase estática o estacionaria es un líquido anclado a un

soporte sólido.

c) Cromatografía líquido-gas: La fase estática o estacionaria es un líquido no volátil impregnado

en un sólido y la fase móvil es un gas.

d) Cromatografía sólido-gas: La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.

Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase móvil
y estacionaria podemos distinguir entre.

a) Cromatografía de adsorción: La fase estacionaria es un sólido polar capaz de adsorber a los

componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.

b) Cromatografía de partición: La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los

componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que son ambas líquidas.

c) Cromatografía de intercambio iónico: La fase estacionaria es un sólido que lleva anclados

grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la
fase móvil.
Clasificación de las técnicas cromatográficas

1. De acuerdo con la forma del lecho cromatográfico:

1.1 Cromatografía plana

Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina” o “en capa delgada”
porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rígido.

Disposiciones experimentales para

realizar una cromatografía en papel
Cromatografía ascendente en capa fina
descendente (izqda.) y ascendente
(dcha.).

Cromatografía ascendente en capa fina: colocación

de una muestra (con 3 componentes), desarrollo de
la cromatografía y revelado del cromatograma.

Rf es el factor de retardo o retraso, que mide la

movilidad relativa de cada componente con
1: aplicación de la muestra
respecto al máximo posible, la distancia recorrida
2: se sumerge el extremo inferior en la
por el frente de fase móvil. fase móvil
3 a 5: la fase móvil asciende por
Componente 1: Rf = a / D capilaridad y se va produciendo la
Componente 2: Rf = b / D separación de los componentes
Componente 3: Rf = c / D 6: se marca el frente de avance del
disolvente y se deja secar la placa
7: revelado de los componentes ya
separados y medida de su avance

1.2 Cromatografía en columna

F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro y varios cm de longitud.

F.M. gas, F.E. sólida: columnas de unos 5 mm de diámetro y 1-20 m de longitud.
F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con menor diámetro y 30-100 m (incluso más) de
longitud.

Puede verse una animación del avance de las moléculas por la columna.

Funcionamiento
de una columna,
mostrando la
carga de la
muestra y diversos
momentos a lo
largo de la elución:

1. Muestra
depositad
a sobre el
lecho
cromatogr
áfico

2. La
muestra
penetra
en el lecho

3. Se añade
fase móvil

4. Comienza
la
separación
 de los
componen
tes de la
muestra

7. Eluye el
primer
componen
te

9. Eluye el
segundo
componen
te

2. De acuerdo con el estado físico de las fases

fase móvil

líquida gaseosa

“cromatografía “cromatografía
líquida” de gases”

Cromatografía Cromatografía
sólida
líquido-sólido gas-sólido
fase
estacionaria
Cromatografía Cromatografía
líquida
líquido-líquido gas-líquido

2.1 Cromatografía de gases

Con fase móvil gaseosa.

 Cromatografía gas-líquido

 Cromatografía gas-sólido

2.2 Cromatografía líquida

Con fase móvil líquida.

 Cromatografía líquido-líquido

 Cromatografía líquido-sólido
2.2.1 HPLC

Cromatografía líquida de alta presión o de alta eficacia (cuando se emplean particulas de fase
estacionaria muy pequeñas y una presión de entrada relativamente alta).
[HPLC, de High Pressure Liquid Chromatography / High Performance Liquid Chromatography]

3. De acuerdo con el mecanismo de separación

Nota: Ésta es una clasificación conceptual; en la práctica, el mecanismo que rige la separación
puede ser mixto; p.ej., adsorción+reparto.

3.1 Cromatografía de adsorción

(atención: es adsorción, no absorción)

Diferente afinidad de adsorción de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido

activo. La adsorción es la capacidad de las superficies para fijar moléculas.

La F.E. es siempre sólida. Ejemplos: alúmina, gel de sílice, carbón activo, fosfato cálcico,
hidroxiapatito...

3.2 Cromatografía de reparto

Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (caso de la

cromatografía de gases), o diferentes solubilidades de los componentes en las fases móvil y
estacionaria (caso de la cromatografía líquida).

Ejemplos: en cromatografía plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la celulosa (papel) o al

soporte sólido que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de
sílice, celulosa en polvo...

3.3 Cromatografía de intercambio iónico

Diferente afinidad de los componentes de la muestra para el intercambio de iones. ¿Qué significa
intercambio de iones? La F.E. posee carga eléctrica y por ello interacciona con los componentes de
la muestra que tienen carga opuesta.

 Intercambio aniónico: F.E. con carga positiva, une aniones, bien los del disolvente (F.M.) o
bien los de la muestra (de ahí la palabra intercambio).

 Intercambio catiónico: F.E. con carga negativa, une cationes, bien los del disolvente (F.M.)
o bien los de la muestra.

Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente a la F.E. sólida):

intercambiadores catiónicos intercambiadores aniónicos

 carboxilato
sulfonato dietilaminoetilo (DEAE)
fosforilo dietil-(2-hidroxipropil)aminoetilo
carboximetilo (CM) polietilenimina
sulfopropilo (SP)

La F.E. suele llamarse “resina” (de intercambio iónico).

Puede verse una animación de una cromatografía de intercambio aniónico.

Las biomoléculas poseen frecuentemente varios grupos ionizables, de modo que su carga eléctrica
neta depende del pH del medio en el que se encuentran (es decir, la F.M.).

3.4 Cromatografía de exclusión

También se llama de exclusión molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamaño, forma

o carga entre las moléculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo más habitual es
aprovechar las diferencias de forma y tamaño. En este caso, se la llama también cromatografía de
exclusión por tamaño, de filtración en gel, de permeación en gel o de tamiz molecular.

Esquema
de la
separación
de
moléculas
de distinto
tamaño
durante
una
cromatogra
fía de
exclusión.

Pulsando
sobre la entrada de fase móvil
imagen de
la columna detector
a la columna
derecha se cromatográfica
mostrará el con
aspecto en relleno poroso
detalle del
 relleno, que señal
ilustra el
diferente
acceso de
las
moléculas a
los poros
dependiend
o del
tamaño de
aquéllas.

Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de exclusión.

Ejemplos: para la separación de proteínas y polisacáridos se usan como F.E. polímeros lineales
entrecruzados (es decir, que forman enlaces transversales). Los más comunes son dextranos
(marca comercial: Sephadex), agarosa (Sepharosa y Biogel A) y poliacrilamida (Biogel P). Estos
materiales, en forma de pequeñas esferas, se expanden o hinchan al sumergirlos en disoluciones
acuosas, generando un retículo o matriz tridimensional, con poros de tamaño definido.

Aplicaciones:

 Para la purificación de una proteína (al igual que otras técnicas cromatográficas).

 Se puede establecer una correlación entre el tamaño molecular y la movilidad en la

columna de exclusión, por lo que esta técnica se emplea para determinar masas
moleculares. Dicha correlación es aproximadamente lineal pero sólo dentro del llamado
“intervalo de fraccionamiento” o “intervalo de resolución” propio del tipo de F.E.
empleado.

 Para eliminar sustancias de pequeño tamaño molecular de una muestra proteica (p.ej., las
sales inorgánicas en un “desalado” de la muestra, eliminación del exceso de reactivos tras
tratar una proteína en el laboratorio, eliminación de inhibidores enzimáticos,...). El
resultado es similar a una diálisis, pero más rápido.

 (más aplicaciones en Freifelder, 1991)

3.5 Cromatografía de afinidad

Variedad particular de cromatografía en la que la separación se basa en la especificidad biológica
singular de interacción entre un componente de la muestra y otra molécula unida a la F.E.; los
ejemplos más comunes son las interacciones enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y ligando-
receptor.

F.E.: un soporte inerte (microesferas de vidrio o plástico, gel de agarosa, ...) al que se une
covalentemente el ligando de afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de
una enzima, anticuerpo, antígeno, hapteno, sustancia transportada, hormona, oligosacáridos,
lectinas (proteínas con afinidad por oligosacáridos)...

Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de afinidad.

4. Algunas técnicas especiales

4.1 Cromatografías de fase normal y de fase invertida

Fase normal: cuando la F.E. es más polar que la F.M.

Fase invertida: cuando es más polar la F.M.

[Nota: se suele ver el término "fase reversa", expresión incorrecta que debe evitarse (la normativa
IUPAC indica que en inglés debe decirse Reversed Phase y no Reverse Phase).]

4.2 Análisis isocrático

La composición de la fase móvil permanece constante a lo largo del proceso de elución.

4.3 Elución con gradiente

La composición de la fase móvil se cambia, de forma continua o en etapas, a lo largo del proceso
de elución (respectivamente, gradiente continuo y gradiente escalonado o en etapas).

4.4 Cromatografía bidimensional

Una vez separados los componentes de la muestra, parte de ellos o todos se someten a etapas
adicionales de separación bajo diferentes condiciones, en otra columna o, en el caso de la
cromatografía plana, en dirección perpendicular.

Ejemplo: Huellas dactilares estudio de proteínas (Freifelder-193ss)

Etapas en la realización de una cromatografía

Cromatografía plana (papel o

Cromatografía en columna
capa fina)

1.- Preparación del soporte y fase estacionaria. 1.- Preparación del soporte y fase
 estacionaria.

1.1.- Equilibrado de la columna.

2.- Aplicación de la muestra.

2.- Aplicación de la muestra.
Secado.

3.- Elución:
a) Lavado de componentes no retenidos. 3.- Desarrollo de la
b) Liberación, desplazamiento o elución propiamente dicha cromatografía.
de los componentes retenidos.

4.- Recolección de fracciones o análisis del efluente en

4.- Secado de la placa.
continuo.

5.- Revelado y cuantificación en

5.- Análisis, cuantificación o revelado.
su caso.

6.- Regeneración de la fase estacionaria.

Recogida del efluente

El efluente de una columna se suele recoger en forma de

pequeñas porciones o fracciones, comúnmente con la ayuda de un
dispositivo mecánico llamado colector de fracciones.

Esquema de un colector de fracciones. En cada tubo cae un

número determinado de gotas o un cierto volumen. A
continuación el soporte gira, de modo que el tubo siguiente queda
colocado bajo la salida del efluente. Las gotas se detectan
mediante una célula fotoeléctrica; cada gota interrumpe el haz de
luz y así se cuenta.

Detección

Los componentes de la muestra separados se detectan en el efluente:

a. Mediante su análisis en continuo. Por ejemplo:

o midiendo absorbancia a 280 nm para proteínas

o midiendo absorbancia a 260 nm para ácidos nucleicos

 o midiendo radiactividad

b. O bien mediante el análisis de las fracciones una vez recogidas.

o cualquier tipo de análisis (absorbancia, radiactividad, ensayo enzimático, ensayo

biológico...)

http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm