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en capa fina y
en columna
Practica 4
Concepto de cromatografía. Tipos de cromatografía.
Cromatografía de adsorción y cromatografía de participación.
Cromatografía: La cromatografía es un método físico de separación para la
caracterización de mezclas complejas cuyo objetivo es separar los distintos
componentes, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia; en el
principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades
de dichos componentes.
Tipos de Cromatografia
Cromatografía de adsorción
La cromatografía líquida de adsorción se caracteriza por utilizar una fase
estacionaria sólida (Adsorbente) de carácter polar y una fase móvil líquida
(Eluyente) apolar, y se utiliza tanto con fines analíticos (identificación de
sustancias) como con fines preparativos (aislamiento), siendo su limitación más
importante la dificultad de separar sustancias de polaridad parecida.
Cromatografía de partición
Técnica de separación de moléculas basada en su diferente solubilidad entre dos
fases inmiscibles. La fase estacionaria es revestida o impregnada con una fase
solvente y la mezcla a separar se pasa en la fase móvil.
Fenómeno de adsorción
La adsorción es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas de gases,
líquidos o sólidos disueltos son retenidos en una superficie,12 en contraposición a
la absorción, que es un fenómeno de volumen. Es decir, la adsorción es un
proceso en el cual, por ejemplo, un contaminante soluble (adsorbato) es eliminado
del agua mediante el contacto con una superficie sólida (adsorbente).
Propiedades de retención
La retención que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a
la diferencia de polaridades entre las fases estacionaria y la móvil, promoviendo
que el soluto se reparta entre ellas según su coeficiente de distribución. De esta
manera, al separarse una mezcla que contenga solutos con polaridad distinta, y
por lo mismo coeficientes de distribución distintos, la retención será diferente para
cada uno.
Concepto de Rf
El símbolo Rf significa “Relación de frentes”, es una relación de distancias, y se
expresa como el cociente entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia
recorrida por el disolvente hasta el frente del eluyente:
El valor de Rf
depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra: tipo de adsorbente,
eluyente, así como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturación,
etc. Tiene una reproducibilidad de 20%, por lo que es mejor correr duplicados de
la misma placa.
Las moléculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la móvil, a esto
se le llama partición puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de
la fisicoquímica del sistema, entre las dos fases. La retención depende de la
solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la matriz sólida, y de
que tanto la fase móvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos
como el analito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase
estacionaria, dentro de la capa Cromatografía en fase líquida a columna abierta
Capítulo 3 Página 29 de solvente adherida a la matriz sólida, y como vemos
también, el analito se distribuye entre la capa de solvente de la fase estacionaria y
otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como está sobre una
columna, por ello se le llaman partición de columna.
Cromatografía de adsorción
La absorción es un fenómeno de superficie, por lo tanto físico, en el cual diversas
sustancias son atrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en
una determinada superficie interfacial, formándose una película del material
retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, sea sólido o líquido, aunque este
proceso implica una interacción de diferentes fuerzas, sean estas físicas o
químicas, por ello se habla de fisisorción, cuando la naturaleza de las fuerzas que
retienen al material es solo física, y quimisorción, cuando la retención implica
enlaces con el adsorbente. Así pues, en la cromatografía de adsorción, se
aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que, si es en
una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual
origina que el analito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los
demás componentes se eliminen. Durante la separación, se filtra una solución a
través de una columna de adsorbente, que es la fase móvil, esta es adsorbida en
la superficie de la fase estacionaria sólida, formando una “cama” de partículas que
se dividen de modo que el área de absorción sea máxima, o sea, se distribuyen a
lo largo del sólido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se
llaman sitios de absorción. El equilibrio entre la fase estacionaria y móvil permite la
separación del analito. Si vemos la ilustración de abajo, los puntos negros
representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es la fase sólida, los
huecos en ella son los sitios de absorción, donde el analito interacciona con la
fase estacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos
materiales, aunque generalmente encontramos la Hidroxiapatita
(Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato de magnesio.
Aplicaciones.
Esta es una de las técnicas cromatográficas más antiguas, su uso depende del
tipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza química, en
particular se usa para la separación de compuestos isoméricos, especies no
polares, hidrocarburos alifáticos, y para compuestos con grupos funcionales
capaces de formar puentes de hidrógeno fuertes, por ello es utilizada para separar
azúcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas así como
oligosacáridos, y también se ha usado para obtener proteínas biliares.
Cromatografía de partición
Cromatografía líquido-líquido La separación de las sustancias se logra por
migración diferencial de los solutos. La fase estacionaria de la cromatografía de
partición es un líquido soportado en un sólido inerte, el más usado es el ácido
silícico o gel de sílice. La fase móvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de
disolventes, la polaridad puede ser notablemente diferente al la del líquido
estacionario. Esta consiste en aplicar una gota de la solución con la mezcla de
substancias a separar en la parte inferior de una tira de papel o en una delgada
capa de un material inerte, como silicagel o celulosa, el papel o material inerte (los
denominaremos soportes) se colocan en un recipiente con un solvente, de manera
que, este los vaya impregnando; el disolvente se elige de manera tal que uno de
ellos se adsorba más al soporte que el otro; a medida que el disolvente avance a
lo largo del soporte los líquidos suben espontáneamente por capilaridad, aquellos
componentes de la muestra que sean más solubles en el líquido que queda
adsorbido serán retenidos, y los que tengan mayor afinidad por el que no se
adsorbe serán arrastrados por este.
Disolvente ideal
Aplicar con un microcapilar la placa
R1-Hexano de gel de silice
R2-Acetona
R3-Metanol
R6-Capilares
Cubrir un frasco con papel filtro
R7- Silica previamente humedecido con el
eluyente
¿Se NO
SI
observaron
las
manchas?
Finalizar la prueba y
seleccionar el eluyente