Guía Prácticas de Técnicas Básicas, prof.

Jaime Antonio Portilla Salinas, Universidad de los

Andes, Departamento de Química (2021), Bogotá – Colombia

CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA Y DE CAPA DELGADA

La cromatografía es una técnica que permite separar los componentes de una mezcla compleja
sorción y posee un alto potencial para aplicaciones en
mediante interacciones físicas de absorción
diferentes áreas de las ciencias en general. En principio, la separación se logra utilizando una fase
estacionaria (generalmente un sólido adsorbente) que retenga los compuestos a separar y, una fase
móvil (generalmente un líquido) que desplaza diferentemente los compuestos a través de la fase
estacionara. Existe diferentes tipos de cromatografía y dentro de cada tipo hay varias distintivos:
i. cromatografía sólido-líquido, la fase estacionaria es un sólido y la fase móvil un líquido siendo
la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC, por sus siglas en inglés) el proceso analítico
más rutinario y poderoso, mientras que la cromatografía de columna preparativa (CC) es la que se
trabaja a nivel de laboratorio de síntesis con el fin de obtener suficiente cantidad de producto puro;
ii. cromatografía líquido-líquido, ambas fases son líquidos y en la estacionaria el líquido se ancla
a un soporte sólido; iii. cromatografía líquido-gas: la fase estacionaria es un líquido no volátil
sobre soporte sólido y la fase móvil un gas; iv. cromatografía sólido-gas: la fase estacionaria es
un sólido y la móvil un gas, destacándose la cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés)
como técnica analítica, que al igual que la HPLC (HPLC-MS, MS proviene de las siglas en inglés
de espectrometría de masas), la técnica puede venir acoplada a un detector de masas (GS-MS, MS)
para hacer la separación y elucidación estructural en paralelo. En general, la mezcla a separar se
deposita sobre la fase estacionaria (existen diferentes maneras según el tipo i a iv) y la fase móvil
atraviesa el sistema desplazando los componentes de la mezcla a velocidades que dependen de la
afinidad de los mismos por cada una de las fases (Figura 1). Se denomina elución a la migración
de los componentes de la mezcla a lo largo de la fase estacionaria impulsados por la fase móvil.

Figura 1. Elución de los componentes de una mezcla

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Hay otras clasificaciones para los distintos tipos de cromatografía. La que depende de la
interacción que se establece entre los componentes de la mezcla y las fases móvil y estacionaria:
cromatografía de adsorción, se producen interacciones de tipo polar siendo la fase estacionaria
un sólido; cromatografía de partición, la separación se basa en las diferencias de solubilidad de
los componentes de la mezcla entre las dos fases siendo ambas líquidas; cromatografía en fase
inversa, la fase estacionaria es menos polar que la móvil; cromatografía de intercambio iónico,
hay intercambios entre iones presentes en la fase estacionaria y los del compuesto orgánico
solubilizado e ionizado en la fase móvil. La que depende del tipo de soporte empleado para la
fase estacionaria: cromatografía en columna, utiliza como soporte una columna de vidrio;
cromatografía en capa delgada, el soporte es una placa de vidrio, aluminio o plástico recubierta
con el adsorbente e incluso de puede utilizar una tira de papel-celulosa que es altamente polar.
La cromatografía se puede emplear para conocer el número de componentes de una mezcla e
identificarlos por comparación (cromatografía analítica) o para separar mezclas de compuestos
(cromatografía preparativa).

Cromatografía de adsorción: en esta se utiliza una fase estacionaria sólida de carácter polar
(adsorbente) y una fase móvil líquida (eluyente) que puede ser un líquido puro o mezcla de dos
para variar su polaridad e interacción con la fase estacionaria y la mezcla. Se utiliza con fines
analíticos y preparativos, la separación de los componentes de la mezcla se determina por las
interacciones polares de los componentes de la misma con las fases estacionaria y móvil, en
consecuencia, los compuestos más difíciles de separar con esta técnica adsorbente serán
aquellos que tengan una polaridad muy similar. La Fase estacionaria (adsorbente) está
constituida por un sólido poroso, finamente granulado, con centros activos polares en su
superficie donde se adsorben las moléculas de la mezcla. A menor tamaño de partícula de este
material, mayor capacidad de adsorción, la cual se debe a interacciones intermoleculares del
tipo dipolo-dipolo, dipolo-dipolo inducido o enlaces de hidrógeno entre el adsorbente y la
mezcla. El adsorbente más utilizado es la sílica gel (Figura 2a), donde las interacciones tienen
lugar entre los grupos Si-OH y Si-O-Si; también se emplea con relativa frecuencia alúmina
(Al2O3). El adsorbente debe ser inerte a los componentes de la mezcla. La sílica gel presenta
carácter ácido y la alúmina puede adquirirse con carácter neutro, ácido o básico.
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Figura 2. a) Estructura de la sílica gel e interacciones con algunos compuestos polares. b) Interacciones en la
cromatografía de absorción, X (centros polares del adsorbente), S (muestra), M (fase móvil).

La fase móvil (eluyente) de este tipo de cromatografía es un disolvente que pueda solubilizar
los componentes de la mezcla. Al aumentar la polaridad del disolvente aumenta la velocidad de
elución de los compuestos de la mezcla. Se puede utilizar un único disolvente o una mezcla de
disolventes e incluso llevar a cabo la elución con un gradiente de polaridad aumentando
progresivamente la proporción del disolvente más polar. Las moléculas de la mezcla S se
adsorben en los centros polares de la fase estacionaria X y, a medida que eluye, van siendo
desplazadas por las moléculas de disolvente (o mezcla de disolventes) que hacen parte de la
fase móvil M. La retención de algún componente de la mezcla se puede justificar por la
competencia que se establece entre S y M por adsorberse a los centros polares X, es decir,
depende de los valores de las constantes de los equilibrios que están en función de la polaridad
del compuesto a eluir (depende drásticamente de sus grupos funcionales) y la naturaleza del
adsorbente y del disolvente (Figura 2b).

El orden de polaridad de los compuestos orgánicos es: ácidos carboxílicos > fenoles >
alcoholes/tioles > aminas > ésteres > aldehídos/cetonas > hidrocarburos aromáticos >
hidrocarburos halogenados > éteres > hidrocarburos insaturados > alcanos. Cuanto más polar
sea un compuesto, más se retendrá en la fase estacionaria clásica (sílica gel). Por ejemplo, se
retiene más un alcohol que un hidrocarburo. El orden de polaridad de la fase móvil más habitual
es: H2O > CH3OH > (CH3)2CHOH (isopropanol) > CH3CN (acetonitrilo) > dioxano >
CH3COOEt (acetato de eltilo) > THF (tetrahidrofurano) > CH2Cl2 (diclorometano DCM) >
CHCl3 (cloroformo) > CCl4 (tetracloruro de carbono) > CH3(CH2)4CH3 (hexano). Para un
mismo compuesto, un aumento en la polaridad de la fase móvil hace que se desplace con más
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facilidad. Por ejemplo, se eluirá más rápido una amina en acetonitrilo que en hexano. Para
compuestos poco polares, con poca retención, se utilizan eluyentes apolares o poco polares
como el hexano. Para compuestos muy polares, que quedan muy retenidos en el adsorbente, se
emplean eluyentes muy polares como metanol o mezclas metanol/DCM. Para compuestos de
polaridad media se emplean eluyentes de polaridad intermedia y son muy aconsejables en estos
caso las mezclas en distintas proporciones de hexano/acetato de etilo.

En La cromatografía en capa delgada (CCD), la fase estacionaria (adsorbente) se encuentra

depositada formando una capa fina de un espesor uniforme sobre una placa de vidrio, plástico
o una lámina metálica (aluminio). La mezcla a analizar se deposita con un capilar a una pequeña
distancia del borde inferior de la placa (Figura 3a) y se introduce en una cubeta (cámara de
CCD) donde está la fase móvil (eluyente) (Figura 3b), que ascenderá a lo largo de la placa por
capilaridad eluyendo a los componentes de la mezcla a distintas velocidades según su mayor
interacción con la fase móvil y/o el adsorbente, lo que provoca su separación (Figura 10c).
Cuando el frente del disolvente se encuentra a ±0.4 cm del borde superior, se saca la placa, se
marca hasta donde ha llegado el eluyente (frente del eluyente) y se deja secar (evaporar el
eluyente) la placa para proceder a observar las manchas correspondientes con un revelador.

Figura 3. Realización de cromatografía de capa delgada CCD. a) Siembra de muestra; c) Introducción

de la placa a la cámara; c) Desarrollo de placa; d) Determinación del Rf de dos compuestos A y B

Se conoce como Rf (rate factor) a la relación entre las distancias recorridas por un compuesto y
por el eluyente desde la siembre (Rf = distancia recorrida por el compuesto/distancia recorrida
por el disolvente). Cada compuesto en unas condiciones cromatográficas determinadas:
adsorbente, disolvente, temperatura, etc., tiene un valor constante y característico de Rf (Figura
3d). Sin embargo, solo se pueden establecer comparaciones entre los Rf de dos compuestos
cuando los dos se eluyen juntos en la misma placa. La distancia recorrida por el compuesto que
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se esté analizando se mide desde el centro de la mancha (Figura 3d).

La placa cromatográfica se visualiza con luz UV. Las placas llevan incorporado un indicador
fluorescente que absorbe luz UV y emite luz visible, generalmente verde. Cuando se le hace
placa a sustancias que absorben en el UV, se ve una mancha que indica su presencia, si no se
observa mancha alguna se utiliza un agente revelador, el cual reacciona con los productos
absorbidos dando lugar a compuestos coloreados y por tanto, se utilizará uno u otro en función
del compuesto que se quiera visualizar (Ej. H2SO4/EtOH para azúcares, yodo para compuestos
insaturados, ninhidrina para aminas, vainillina, etc.). La CCD es una técnica cualitativa muy
usada en los laboratorios de Química Orgánica, particularmente síntesis orgánica y productos
naturales, para determinar el número de componentes de una muestra. Si solo hay una mancha
muy retenida o aparece junto al frente del disolvente hay que probar otro eluyente (Figura 4a).

Figura 4. a) Separación de dos componentes A y B. Eluyente: i poco polar, ii polaridad adecuada y iii muy polar.
b) i. Comprobación de la no separación de A y B, M = mezcla de ambos; ii Evolución de una reacción de A y B
que produce C, MR = mezcla de reacción. iii Análisis de las fracciones (1,2...10) de una CC, M = mezcla inicial.

Al comprobar la pureza de un compuesto aparecerá una sola mancha. Se debe comprobar que
solo hay una mancha utilizando distintos eluyentes (Figura 4ai, 4aii y 4aiii). En la determinación
de la identidad de dos compuestos hay que tener precaución, ya que los valores de Rf iguales (o
muy parecidos) para dos compuestos en una misma placa no garantizan inequívocamente su
identidad. En la misma placa se debe sembrar una mezcla de los compuestos cuya identidad se
quiere comprobar para asegurar que el punto corresponde a un solo compuesto (Figura 4bi).
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Para seguir la evolución de una reacción, cada cierto tiempo se le hace cromatografía en una
misma placa a los reactivos y la mezcla de reacción (Figura 4bii). La CCD sirve para determinar
el disolvente más apropiado para llevar a cabo una separación mediante un proceso de
cromatografía preparativa (bien sea en columna o en placa) y para seguir el progreso de una un
proceso de la cromatografía en columna CC (Figura 4biii).

La cromatografía en columna (CC) es el método más útil para separar y purificar compuestos
orgánicos (sólidos o líquidos) a escala preparativa. La fase estacionaria se coloca en una
columna de vidrio que termina con una llave y se impregna con la fase móvil (Figura 5ai).

Figura 5. a) Proceso general de una CC: i Montaje CC; ii mezcla eluyendo, separándose y colectándose; iii
luego de varios pasos, se colectan las fracciones en tubos de ensayo etiquetados; iv se juntan las fracciones del
mismo tipo; v evapora el eluyente de cada balón a presión reducida (en rota-evaporador). b) i Paso a paso del
proceso de CC luego de la salida del compuesto menos retenido y ii componentes del rota-evaporador.
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La mezcla a separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase móvil atraviesa el
sistema (Figura 5aii). Los compuestos se van eluyendo disueltos en la fase móvil se van
recogiendo ordenadamente en fracciones de pequeño volumen (1,2,...) y se analizan por CCD
(Figura 5aiii), luego se juntan las fracciones del mismo tipo en balones esmerilados según lo
observado en la CCD (Figura 5aiv) y finalmente, se evapora el eluyente a presión reducida (en
rota-evaporador) para cada balón que contiene la respectiva fracción (Figura 5av). Los
productos van saliendo de la columna según su polaridad, primero salen los menos polares que
son los menos retenidos por el adsorbente y los últimos los más polares por su mayor retención
en la fase estacionaria (la sílica gel es el adsorbente más utilizado), Figura 5b. El tamaño de
partícula del adsorbente es importante para la separación y su elección depende en gran medida
de que la elución de la cromatografía se realice por gravedad o a presión. En una elución bajo
presión, se pueden emplear tamaños de partícula de la fase estacionaria más pequeños, lo que
permite una separación más eficaz. Sin embargo, en una elución por gravedad el uso de tamaños
de partícula pequeños impide el flujo del disolvente. Antes de realizar una separación por CC
se elige el disolvente adecuado haciendo ensayos en CCD.

Materiales y equipos
Cantidad Material Cantidad Material
1 Montaje para cromatografía de columna 1 Varilla de vidrio
10 Tubo de ensayo 1 Gotero
1 Embudo con caña, Beaker, Erlenmeyer 1 Vidrio de reloj
10g Sílica gel 60F254 (0063-0.2 mm) Algodón o lana de vidrio
1 Cromatoplacas (AlSílicaGel)60F254 4X8 cm Papel de filtro

Reactivos, disolventes y disoluciones

Sustancia Cantidad
Agua destilada 80 mL
Etanol 70 mL
Disolución de cristal violeta y naranja de metilo (1/1) 2 mL
Trietilamina 5 mL

Procedimiento experimental

Separación por CC de una mezcla cristal violeta/naranja de metilo. Se sujeta la columna, en

posición vertical, a un soporte utilizando dos pinzas, una cerca de la llave y otra en la parte
superior. Luego se introduce un pequeño un copo de algodón en su extremo inferior. Se coloca
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un Erlenmeyer o tubo de ensayo debajo de la columna y un embudo en la parte superior (Figura
5a1). En un Beaker se prepara una suspensión con 5g de sílica gel (adsorbente) y 50 mL de
etanol (eluyente). Se añade un poco de etanol a la columna y luego se vierte la suspensión
previamente preparada en su interior. Se abre la llave, se golpea suavemente las paredes de la
columna mientras precipita el adsorbente para que este se compacte adecuadamente procurando
que no se formen burbujas y evitando que se seque la sílica. El etanol que se va recogiendo de
la columna se incorpora al vaso donde se preparó la suspensión adsorbente/eluyente para así
recuperar la sílica que hubiera podido quedar y se transvasa todo de nuevo a la columna.

Se deja que el eluyente baje hasta una altura sobre el adsorbente de 1 a 2 mm, se cierra la llave
de la columna se quita el embudo y con una pipeta Pasteur (gotero) se añade cuidadosamente
un poco de una solución preparada de cristal violeta y naranja de metilo (±1 mL). Se abre la
llave de la columna para que esta disolución quede inmersa en la sílica y se vuelve a cerrar
cuando la disolución de colorantes alcanza una altura de 1 mm sobre el adsorbente. Se añaden
con una pipeta 5 mL de etanol con mucho cuidado y muy lentamente para no distorsionar el
frente de la columna. A continuación, se abre la llave y se continúa añadiendo etanol para
desarrollar la columna hasta que se recoja el primer colorante. Después se utiliza una mezcla de
disolventes: etanol/trietilamina en proporción 9:1 como eluyente para el segundo colorante
(proceso parecido al de la Figura 5bi) ¡Durante todo el proceso nunca debe secarse la columna!

Figura 6. Estructura molecular de naranja de metilo y de cristal violeta.

El naranja de metilo es un colorante azoico (los derivados de azo-compuestos contienen el grupo

auxocromofórico -N=N-, son compuestos intensamente coloreados y muchos se emplean como
colorantes en la industria) que se utiliza como indicador ácido-base y es amarillo en medio
básico y rojo en medio ácido. El cristal violeta es un colorante derivado del tris-4-
(dimetilamino)fenilmetano. Ambos compuestos son muy polares (Figura 6). Se debe tomar nota
de los resultados obtenidos y discutir la separación obtenida. Las diferentes fracciones de la
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separación por cromatografía se recogen en tubos de ensayo rotulados (No.1, No.2,…). Para
notar mejor el experimento, se coloca un papel de blanco detrás de las gotas que van cayendo).
Cromatografía en capa delgada. Se toman 2 Beaker de 50 mL con 2 vidrios de reloj (tapa)
como cámaras de cromatografía y se rotulan (A y B), ver la Figura 3. Los disolventes de elución
son: A agua/etanol (1/10) y B agua/etanol (10/1). Se coloca en las cámaras alrededor por la parte
interna una tira de papel y una cantidad de la mezcla de disolventes para elución, suficiente para
que al introducir la placa, esta se humedezca en todo el borde inferior (el nivel del disolvente
debe quedar por debajo de la siembra aplicada (mancha). El instructor lo debe proveer de dos
placas de CCD. Se coloca en cada una un punto de la mezcla de tintes y un punto de la disolución
del tinte puro soluble en etanol (también lo entregará el instructor), a aproximadamente 0.5 cm
del borde. Para esto se sumerge un capilar bien fino en la mezcla de tintes y se toca levemente
la superficie de la placa para transferir una cantidad bien pequeña de mezcla. La mancha que se
forma no debe ser más grande que la cabeza de un alfiler. Con capilares diferentes (no confundir
los capilares de cada disolución) haga lo mismo con las disoluciones de los tubos de ensayo
No.3 y No.5. Se coloca la placa en la cámara A hasta que llegue el disolvente hasta ~0.4 cm del
borde superior de la placa. Note el tipo de separación obtenida. Se saca la placa y antes que se
evapore el disolvente, se marca con un lápiz hasta donde llegó éste. Se repite el proceso con
otra placa, pero en la cámara B. Se calcula el Rf para cada mancha en las dos placas. Cuál
sistema de disolventes es mejor para separar la mezcla de tintes.
Recomendaciones. Para golpear la columna mientras se empaca, utilice una varilla de vidrio
forrada con un tubo de caucho u otro material que no la rompa. Los pares de tintes que se pueden
utilizar para esta práctica son: fluoresceína/azul de metileno, naranja de metilo/azul de metileno
o naranja de metilo/cristal violeta. Trabaje con 1 mg de cada tinte, disuélvalos en etanol
comercial (96%). Se recomienda utilizar lana de vidrio en lugar de algodón, ya que algunos
componentes tiñen el algodón, obstaculizando una buena separación (aquí sí se puede algidón).

Resultados y observaciones
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Preguntas
1. ¿Por qué los derivados halogenados suben más que los alcoholes en una cromatografía de
placa delgada?
2. Al cambiar un eluyente menos polar por otro más polar ¿cómo se afecta la velocidad de
elución de un alcohol? ¿y la de una cetona?
3. El valor del Rf ¿depende del adsorbente utilizado? ¿y del eluyente?
4. Sugerir un ensayo para determinar la pureza de un compuesto por CCD.
5. Sugerir un ensayo (utilizando la CCD) para determinar ¿Cuál es el disolvente más adecuado
para separar el ácido difenilacético del bencilfeniléter por cromatografía en columna utilizando
sílica gel como adsorbente.
6. Explique ¿por qué y cómo se separan los compuestos de la mezcla de tintes?
7. ¿En qué consiste la CCD preparativa?
8. ¿Qué es una resina de intercambio aniónica y una catiónica?
9. Indique algunas aplicaciones de la cromatografía de adsorción por columna.

BIBLIOGRAFÍA

1. Vogel, A. “Elementary Practical Organic Chemistry. Part. I: Small Scale Preparations” 5a Ed. (1989);
Longmans, Great Britain.
2. Portilla, J. “Manual teórico-práctico para el laboratorio de química orgánica en pequeña escala”
Universidad de los Andes, Departamento de Química (2009); Bogotá Colombia.
3. Manual de Prácticas de Laboratorio de Química orgánica. Universidad de Alcalá, Facultad de
Farmacia, Departamento de Química Orgánica, España.
4. Insuasty, B.; Ramírez, A. “Prácticas de Química Orgánica en Pequeña Escala” Univalle, Facultad
de Ciencias, Departamento de Química, Cali-Colombia.
5. Morrison, R.T.; Boyd, R. N. “Química Orgánica” 5ª Ed. (1989); Pearson Educación.
6. Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S. Organic Chemistry 2a Ed (2012).