2.

CROMATOGRAFÍA
Las técnicas cromatográficas separan una proteína de otra con base en la diferencia de su
tamaño, carga, hidrofobicidad o capacidad para unirse a un ligando específico.
Los sistemas de cromatografía contienen una fase estacionaria y una fase móvil, por donde
los componentes a separar se distribuyen, así el proceso cromatográfico se da como
resultado de repetidos procesos de sorción-desorción durante el movimiento de los
componentes de la mezcla arrastrados por la fase móvil a lo largo de la fase estacionaria.
Produciéndose la separación debido a las diferencias en las constantes de distribución de
los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la móvil. A la distribución final
de los componentes en función de su posición sobre el lecho estacionario se le denomina
cronograma.
 Fase Estacionaria: Permanece inmóvil. Esta permite el paso del diluyente sobre sí
mismo, con el objetivo de propiciar el contacto entre las dos fases de la mezcla.
Puede ser un sólido, gel o un líquido
 Fase Móvil: Corresponde al fluido que moviliza las sustancias que se pretenden
separar o identificar a través de la fase estacionaria en una dirección definida.
Diferentes fases móviles y fases estacionarias en diferentes técnicas de cromatografía:

Tabla 1: Diferentes Técnicas de Cromatografía

Cromatografía De Columna:
Tiene como elementos un material solido poroso (matriz) que se deposita en el interior de
la columna que podría ser de vidrio, platico o acero. Una disolución, corresponde a la fase
móvil, esta fluye a través de la matriz, la fase estacionaria. La disolución que sale por la
parte inferior de la columna el efluente, será remplazada constantemente por una disolución
suministrada de un deposito en la parte superior. La disolución de proteína a separar se
deposita sobre la cabeza de la columna y se deja percollar hacia el interior de la matriz
sólida, se va añadiendo mas disolución sobre ella. La disolución de proteína forma una
banda dentro de la fase móvil que tiene inicialmente una anchura que va extendiéndose a
medida que se desplaza a través de la columna, ya que se retarda en diferentes grados en
virtud de su interacción diferencial con el material de la matriz.

Figura 1 Cromatografía en columna

Cromatografía De Intercambio Iónico:

Considera las diferencias en el signo y la magnitud de las cargas eléctricas netas de las
proteínas a un pH determinado. Se basa en que las proteínas interactúan con la fase
estacionaria por interacciones carga – carga.
La matriz de la columna es un polímero sintético(resina) que tiene unidos bien grupos
aniónicos denominados intercambiadores catiónicos como carboxilatos o sulfatos, sobre
los cuales se adhieren proteínas con una carga neta positiva y Ph determinado; y grupos
catiónicos denominados intercambiadores anionicos como aminas terciarias o
cuaternarias, sobre los cuales se adhieren proteínas con una carga neta negativa y Ph
determinado. Las proteínas no adherentes fluyen a través de la matriz y se eliminan por
medio de lavado. A continuación, las proteínas unidas son desplazadas de manera selectiva
al aumentar gradualmente la fuerza iónica de la fase móvil, lo que debilita interacciones
entre una carga y otra. Hay elusión de proteínas en orden inverso de la fuerza de sus
interacciones con la fase estacionaria.

Cromatografía De Exclusión molecular:

se separan las proteínas con base en su radio de Stokes, el radio de la esfera que ocupan a
medida que entran en solución. se emplean cuentas porosas. A medida que los objetos se
mueven torrente abajo, los que entran en una irregularidad se retrasan hasta que regresan a
la corriente principal. De modo similar, las proteínas con radios de Stokes demasiado
grandes como para entrar en los poros (proteínas excluidas) permanecen en la fase móvil
que está fluyendo y salen antes que las que pueden entrar en los poros (proteínas incluidas).
Así, las proteínas surgen a partir de una columna de filtración en gel en orden descendente
de sus radios de Stokes.

Cromatografía De Afinidad
Se basa en la afinidad de unión de las proteínas. Las partículas de la columna tienen en este
caso un grupo químico unido covalentemente llamado ligando, un grupo o molécula que se
une a una macromolécula, por ejemplo, una proteína. Cuando se carga de una mezcla de
proteínas en la columna, cualquiera de ellas que tenga afinidad por este ligando se unirá a
las partículas de resina, retardando así su migración a través de la columna.
Referencias bibiografica:
1. Rodwell y col. Harper.Bioquímica ilustrada. 31°ed. Mexico 2018
2. Passaro C, Rivera M, Roman M, Cardona L, Muñoz L, et al. Guía Sobre
Principios Básicos De Cromatografía Y Sus Aplicaciones. Antioquia, Colombia.
2016
3. Nelson D, Cox M .Lehninger. Principios de Bioquímica, 7ma edición,2019