El formaldehdo, paraformaldehdo formalina, y

glutaraldehdo:
Qu son y qu hacen.
John A. Kiernan,

Departamento de Anatoma y Biologa Celular,

La Universidad de Western Ontario
LONDRES, Canad N6A 5C1

Los aldehdos son los fijadores ms comnmente utilizados. Sirven para estabilizar los
detalles finos estructurales de las clulas y los tejidos antes de examen mediante
microscopa ptica o electrnica. Los investigadores, tcnicos, patlogos y otros que
regularmente utilizan fijadores aldehdo con frecuencia no aprecian la naturaleza y
propiedades de estos compuestos o las razones para la eleccin de fijar una muestra en
formaldehdo, glutaraldehdo o una mezcla de los dos. Malentendidos estn muy
extendidos tambin sobre formalina y paraformaldehdo, los productos comerciales de
formaldehdo que contienen soluciones estn hechas.

Propiedades de formaldehdo y sus polmeros

El formaldehdo es un gas. Sus molculas pequeas (HCHO, de los cuales el CHO-es

el grupo aldehdo) se disuelven rpidamente en agua, con el que se combinan
qumicamente para formar hidrato de metileno, HO-CH 2-OH. Esta es la forma en la
que existe formaldehdo en soluciones acuosas; su reactividad qumica es la misma que
la de formaldehdo. Molculas de metileno hidrato reaccionar unos con otros, la
combinacin de polmeros de forma (fig. 1). El lquido conocido como formalina
contiene 37-40% de formaldehdo y 60-63% de agua (en peso), con la mayor parte del
formaldehdo existir como polmeros de bajo (n = 2 a 8 en la frmula dada en la fig. 1).
Mayores polmeros (N hasta 100), que son insolubles, se venden como un polvo blanco
paraformaldehdo,.

Fig. 1. Formacin de polmeros

de formaldehdo (arriba), y
despolimerizacin de
paraformaldehdo (abajo).

Para ser til como un fijador,

una solucin debe contener
formaldehdo monomrico (o
hidrato de metileno, para ser
pedante) como su principal
soluto. La dilucin con agua se
rompe los polmeros pequeos en
formalina. Este proceso se dice
que tiene un par de das si se utiliza agua pura, pero para ser casi instantnea cuando
formalina se diluye con una solucin tampn a pH fisiolgico (Pearse, 1980). La
hidrlisis de los polmeros es catalizada por los iones de hidrxido presentes en la
solucin ligeramente alcalina (Fig. 1). Las grandes molculas de polmero en
paraformaldehdo necesitan un tratamiento ms enrgico. El calentamiento es
necesario, como es una fuente adicional de iones hidrxido. En uno de los primeros
paraformaldehdo derivados de fijadores (Richardson, 1960) se trataba de sulfito de
sodio, pero la prctica regular durante al menos 35 aos ha sido simplemente para
calentar el paraformaldehdo a 60 C en agua que contiene las sales utilizadas para
amortiguar la solucin a pH 7,2 a 7,6.

La formalina contiene alrededor del 10% de metanol, aadido por el fabricante, ya que
ralentiza la polimerizacin que conduce finalmente a la precipitacin de
paraformaldehdo. Una solucin de formaldehdo al 4% a partir de formalina por lo
tanto, contiene aproximadamente el 1% de metanol. Tambin contiene una pequea
cantidad de iones de formiato. Estos se derivan de la reaccin de Cannizzaro, en la que
dos molculas de formaldehdo reaccionan entre s, uno de reducirse a metanol y el otro
oxida a cido frmico. Debido a esta reaccin lenta, las concentraciones de metanol y
formiato en cualquier solucin de formaldehdo al aumentar lentamente con un
almacenamiento prolongado (Walker, 1964). Una solucin de formaldehdo preparada
a partir de paraformaldehdo, que inicialmente no contiene ninguna metanol, se utiliza
comnmente en fijadores para microscopa electrnica y en aplicaciones de
investigacin. Preservacin ultraestructural satisfactorio es, sin embargo, tambin se
observa en tejidos fijados en formaldehdo tamponado generado a partir de formalina
(Carson y col., 1973).

La reaccin de formaldehdo con protenas

El grupo aldehdo se puede combinar con el nitrgeno y algunos otros tomos de las
protenas, o con dos tomos de este tipo, si estn muy cerca entre s, formando una cruz-
link-CH2-llama un puente de metileno. Los estudios de la qumica de curtido indican
que el tipo ms frecuente de reticulacin formado por formaldehdo en el colgeno es
entre el tomo de nitrgeno al final de la cadena lateral de lisina y del tomo de
nitrgeno de un enlace peptdico (fig. 2), y el nmero de tales enlaces cruzados aumenta
con el tiempo (Gustavson, 1956). El curtido de colgeno para hacer cuero es
comparable al endurecimiento de un tejido por un fijador (Hopwood, 1969). La accin
fijadora de formaldehdo probablemente se deba enteramente a sus reacciones con las
protenas. Consolidacin inicial de formaldehdo a la protena est casi terminada en 24
horas (Helander, 1994), pero la formacin de puentes de metileno procede mucho ms
lentamente. Sustancias tales como carbohidratos, lpidos y cidos nucleicos se
encuentran atrapados en una matriz de molculas de protenas insolubles y reticulado,
pero no estn qumicamente modificado por el formaldehdo menos que la fijacin se
prolonga durante varias semanas.
 Fig. 2. Reacciones
implicadas en la
fijacin por el
formaldehdo. (A)
La adicin de una
molcula
Formaldehyd a una
protena. (B) La
reaccin de
formaldehdo
enlazado con otra
molcula de
protena para
formar un enlace
cruzado de
metileno. (C) Una
descripcin ms
detallada de la cruz
-linking de una
cadena lateral de
lisina a un tomo de
nitrgeno pptido.

Consideraciones
prcticas en relacin con formaldehdo

Este es el bit ms importante. El formaldehdo penetra rpidamente los tejidos

(molculas pequeas), pero sus reacciones con las protenas, especialmente la
reticulacin, ocurren lentamente. La fijacin adecuada es cuestin de das, sobre todo si
la muestra tiene que soportar las tensiones osmticas y de otro tipo de deshidratacin y
la infiltracin con parafina. Breve fijacin en formaldehdo (idealmente entregado por
perfusin) puede detener o reducir en gran medida autolisis y conferir ligero
endurecimiento y algo de resistencia (pero no mucho) a los lquidos que no son iso-
osmtica con el tejido. Esto puede mejorar mucho la integridad estructural del criostato
y otras secciones congeladas, especialmente si es seguido por la infiltracin con un
crioprotector tal como sacarosa (idealmente 60%, pero ms usualmente 15-30%).

Cuando una muestra es deshidratado despus de slo unas pocas horas en

formaldehdo, las protenas citoplasmticas en gran medida no fijadas son groseramente
coagulada. Nuclear cromatina, que contiene ADN y las protenas fuertemente bsicas,
tambin se coagula por el disolvente, formando un patrn de hilos, terrones y grnulos.
Esto no es diferente a la aparicin inducida por fijadores que contienen cido actico,
pero es menos satisfactorio para la identificacin de los tipos de clulas sobre la base de
la morfologa nuclear. (Despus de la fijacin de formaldehdo adecuada, cromatina
muestra una notable incluso textura, tambin de poco valor diagnstico, pero
posiblemente ms cerca de la estructura del ncleo viviente.)

Las soluciones de glutaraldehdo

 Antes de 1962 slo el fijador satisfactorio para la microscopa electrnica se tamponada
de tetrxido de osmio. Esto preserva la estructura celular mediante la combinacin con
los lpidos, especialmente en las membranas, y por insolubilizacin algunas protenas
sin coagulacin, pero es costoso y txico, penetra tejidos extremadamente despacio, y
extrae la protena mucho y ARN. Con la introduccin de glutaraldehdo (Sabatini et al.,
1962) microscopistas de electrones tena un fijador ms rpidamente penetrante que
bien insolubilizado protenas y era lo suficientemente barato para entregar por perfusin
vascular.

El glutaraldehdo tiene molculas bastante pequeas, cada una con dos grupos aldehdo,
separados por una cadena flexible de 3 puentes de metileno. Es de HCO-(CH2) 3-CHO. El
potencial para la reticulacin es, obviamente, mucho mayor que con formaldehdo
debido a que puede producirse a travs de ambos el-CHO grupos y sobre distancias
variables. En soluciones acuosas, el glutaraldehdo est presente en gran parte como
polmeros de tamao variable (Monsan et al., 1975). Hay un grupo aldehdo libre que
sobresale del lado de cada unidad de la molcula de polmero (fig. 3), as como una en
cada extremo. Todos estos grupos-CHO se combinar con los nitrgenos de protenas
con las que entran en contacto, por lo que existe un enorme potencial para la
reticulacin, y eso es precisamente lo que ocurre (Fig. 4). Tambin hay muchos
sobrantes grupos aldehdo (que no est obligado a nada) que no pueden ser lavados
fuera del tejido.

Fig. 3. (A) Tres representaciones de una molcula de glutaraldehdo monomrica. (B)

reaccin de polimerizacin de glutaraldehdo, mostrando un aldehdo de cadena lateral
en cada unidad del polmero.
 Fig. 4. Reaccin de
poli (glutaraldehdo)
con grupos amino de
las protenas.

Aspectos prcticos
de la fijacin con
glutaraldehdo

Cinco puntos
importantes que
deben tenerse en
cuenta cuando se
utiliza como fijador
de glutaraldehdo
para microscopa
ptica o electrnica.

1. Si es para ser cualquier uso como un fijador, especialmente para la microscopa

electrnica, la solucin de glutaraldehdo debe contener el monmero y polmeros de
bajo (oligmeros) con molculas pequeas como para penetrar en el tejido con bastante
rapidez. Esto significa que usted debe comprar un "grado EM" glutaraldehdo (25% o
50% de solucin), no ms barato "tcnico" de grado. El material ms barato, que es
para curtir pieles, se compone principalmente de molculas de polmero demasiado
grandes para caber entre las macromolculas de las clulas y otros componentes del
tejido.

2. La reaccin qumica de glutaraldehdo con la protena es rpido (minutos a horas),

pero las molculas ms grandes, especialmente los oligmeros, penetrar en el tejido
lentamente. Cerebro de una rata dej durante la noche en una solucin de
glutaraldehdo tamponado y en rodajas al da siguiente muestra un cambio de color y
consistencia ms dura a una profundidad de 2-3 mm. Objetos fijados por unas pocas
horas en glutaraldehdo ya no son sensibles osmticamente (Paljarvi et al., 1979).

3. Los grupos aldehdo libres introducidos por fijacin glutaraldehdo causar varios
problemas. Estos incluyen no especficos de unin de los reactivos protenicos,
anticuerpos, y en particular una reaccin directa positiva con el reactivo de Schiff). Los
aldehdos libres debe ser eliminado o bloqueado por los procedimientos adecuados de
histoqumicas, como se describe en los libros de texto (Matanza y otros, 1985;. Kiernan,
1999, Ruzin, 1999), antes de tratar de inmunohistoqumica, histoqumica de lectinas, la
reaccin de Feulgen del cido peridico de Schiff-tincin en glutaraldehdo material
fijado.

4. La reticulacin a fondo de un espcimen glutaraldehido fijo impide la penetracin

de las molculas de cera de parafina bastante grandes. Esto hace que para el corte
difcil y peculiares artefactos contraccin diferencial dentro de la muestra. Usted puede
manchar las mitocondrias en las clulas muy bien rodeados de espacios, obviamente
anormales. Se trata de una exageracin de la insuficiencia de formaldehdo y de
tetrxido de osmio como fijadores de preceder parafina (Baker, 1958), y tambin pone
de relieve las deficiencias de los fijadores sobre todo anticoagulantes (AFA de
Davidson, Bouin, etc), que conservan la anatoma micro-bien, pero destruir o desplazar
a las pequeas cosas como orgnulos. Afortunadamente, los monmeros de plstico
penetrar glutaraldehdo tejido fijado adecuadamente. Se ha demostrado que no entran
en cada grieta (Horobin y Tomlinson, 1976), pero hay apoyo suficiente para permitir el
corte de secciones ultrafinas para microscopa electrnica.

5. Inmunohistoqumica, que requiere tantas intactas aminocidos cadenas laterales

como sea posible, se ve seriamente afectada por la fijacin glutaraldehdo. Sin
embargo, las personas inteligentes han generado anticuerpos para los aminocidos
individuales, que son glutaraldehdo enlazado a la protena. Esto permite la deteccin
de aminocidos neurotransmisores solubles como el glutamato, GABA y glicina,
incluso en las terminales de los axones presinpticos en glutaraldehdo-perfusin del
tejido nervioso central (Hodgson et al, 1985;. Hepler y col, 1988;. Crooks y Kolb,
1992). Amplia entrecruzamiento tambin se traduce en la prdida o reduccin grave de
la mayora de las actividades enzimticas histolgicamente demostrables, aunque
algunos se conservan despus de la fijacin breve (Sabatini et al., 1962).

Las mezclas que contengan formaldehdo y glutaraldehdo

La combinacin de formaldehdo con glutaraldehdo como un fijador para la

microscopa electrnica se aprovecha de la rpida penetracin de pequeas molculas
HCHO, que inician la estabilizacin estructural del tejido. Rpida y completa de
reticulacin se produce por los oligmeros de glutaraldehido ms lentamente
penetrantes. Esta mezcla se asocia con el nombre de Morris J. Karnovsky de Boston.
Es un ejemplo de una gran innovacin que slo se public en un resumen sin referencias
(Karnovsky, 1965). Su mezcla original contena 4% de glutaraldehdo, que era una
concentracin ms alta de lo que muchos queran usar (Hayat, 1981). Denominaciones
como "mitad de su fuerza Karnovsky" se convirti en el lenguaje comn en los aos
1960 y 1970. Los fijadores de este tipo permite las descripciones definitivas de la
histologa de EM-nivel que fueron realizadas en los 5 o 6 aos que siguieron a la
introduccin de la fijacin de Karnovsky, y que todava se utilizan de forma rutinaria.

Referencias

Baker, JR (1958). Principios de microtcnica Biolgica (Reimpresin 1970, con

correcciones). Londres: Methuen.

Carson, FL, Martin, JH y Lynn, JA (1973). La fijacin en formol para microscopa

electrnica: un diario de re-evaluacin Americana de Patologa Clnica 59:. 365-373.