Protocolo de Histoqumica Protocolo para histoqumica

Protocolo de histoqumica para Biopsia Renal:

Biopsia renal: Mtodo de estudio de las enfermedades renales, que permite establecer el diagnostico exacto, orientar tratamiento, valorar actividad y cronicidad de la enfermedad, as como aclarar el pronostico. La biopsia renal es la nica forma de describir nuevas enfermedades, incluyendo el efecto adverso de diversas drogas. Finalmente, es absolutamente requerida en estudios clnicos para asegurar que la severidad de una enfermedad determinada es comparable entre los diferentes grupos de estudio, adems de servir como base para la evaluacin de efectos teraputicos Una biopsia es un procedimiento por el que se extraen clulas o tejidos del cuerpo para analizarlos con un microscopio. Durante una biopsia renal, se extraen muestras de tejidos con una aguja especial para determinar la presencia de cncer o de otras clulas anormales, o para evaluar el funcionamiento del rin. Importancia de la biopsia renal: La Biopsia Renal sigue siendo una herramienta diagnstica de primer orden, de beneficio no tan slo para la ampliacin de experiencia del nefrlogo sino, sobre todo, para el porvenir del enfermo. Las situaciones clnicas del sndrome nefrtico e insuficiencia renal aguda son los dos ms claros exponentes de ello. Conocer la histologa de muchas nefropatas permitir plantear estrategias de prevencin, diagnstico y tratamiento a fin de controlar el impacto de estas enfermedades en la progresin a estadios terminales Tratamiento de la Biopsia Renal: Una vez obtenida la biopsia renal, esta debe ser inmediatamente fijada en formol baferado, para que pueda mantener sus propiedades intactas y la biopsia no se malogre o estropee. Esta muestra es procesada en el AUTOTECNICON el cual se encargara de fijar en formol, deshidratar en alcohol de menor a mayor grado; se lleva al rea de inclusin, donde es incluido en parafina para luego realizar los cortes necesarios en el micrtomo. Laboratorio de Anatoma Patolgica Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo.

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Las lminas deben estar tratadas con alguna solucin adherente como es el caso de la POLIHELILISINA, la cual har que el tejido no se desprenda de la lmina. Una ves realizado todo este procedimiento se realizan las tinciones especiales q el medico patlogo pide, para su adecuado diagnostico. Tinciones para la biopsia renal:

Tincin tricrmica de Masson

La tincin tricrmica de Masson, al igual que otras tinciones tricrmicas, es una tcnica de coloracin especial que permite visualizar claramente las fibras de colgeno tipo I que forman fibras gruesas o haces, diseados para dar resistencia; tambin evidencia, aunque en menor intensidad, las fibras reticulares. Se emplean tres colorantes para diferenciar el ncleo celular, el citoplasma y las fibras de colgeno. Fundamento Primeramente, se tien las secciones con un tinte cido tal como escarlata de Biebrich. Todos los elementos acidfilos del tejido tales como el citoplasma, el msculo y el colgeno tipo I se unirn a los tintes cidos. Las secciones entonces se tratan con cido fosfotngstico y/o fosfomolbdico. Ya que el citoplasma es mucho menos permeable que el colgeno, los cidos fosfotngsticos y fosfomolbdicos permiten que la escarlata de Biebrich difunda del colgeno pero no del citoplasma. Los cidos fosfotngsticos y fosfomolbdicos tienen numerosos grupos cidos que probablemente acten como medio de unin entre el colgeno y el azul de la anilina, que es el tinte del colgeno. Probablemente, el pH de la solucin fosfotngstico/fosfomolbdico tambin aumente la coloracin y ayude al colgeno en la difusin o el retiro de los colorantes. Procedimiento 1. Desparafinar en xilol 3 veces por cada 3 min, hidratar la muestra en alcoholes de mayor a menor grado cada 3 minutos. 2. Lavar en agua destilada. 3. Teir con la solucin de escarlata-fucsina cida durante 2-5 minutos. Laboratorio de Anatoma Patolgica Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo.

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4. Lavar en agua destilada. 5. Tratar con la solucin de cido fosfomolbdico-fosfotngstico durante 10-15 minutos si se va a colorear con la solucin de azul de anilina, o en la solucin acuosa de cido fosfotngstico al 5% durante 15 minutos si se desea teir con verde luz. 6. Teir con solucin de azul de anilina 15 minutos o con solucin de verde luz 5 minutos. 7. Lavar en agua destilada. 8. Teir con hematoxilina frrica durante 1 minuto. Lavar en agua corriente 9. Deshidratar, aclarar y montar. Anlisis de resultados

Fibras de colgeno = Azul.

Por tanto, el tejido conjuntivo se teir de dicho color.

Estructuras oxidadas + Citoplasma = Rojo.

Se teirn de rojo la queratina, los glbulos rojos y el tejido muscular.

Ncleo celular = Lila, marrn.

Optimizacin

Ncleos demasiado claros: aumentar tiempo de incubacin en reactivo de Weigetr b. Rojo demasiado fuerte: disminuir la temperatura de la incubacin de la solucin escarlata de Biebrich y fucsina acida.

Rojo demasiado claro: aumentar temperatura de la incubacin de la solucin escarlata de Biebrich y fucsina acida y su aclarado posterior.

Azul demasiado oscuro: disminuir temperatura o tiempo de incubacin en azul de anilina y aclarado con baffer, luego disminuir tiempo de o temperatura de incubacin del cido fosfotustico.

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Azul demasiado claro: aumentar temperatura o tiempo de incubacin en azul de anilina y aclarado

Tincin PAS
La tcnica de PAS se utiliza en los preparados para microscopia ptica, permite la tincin de componentes celulares que contienen hidratos de carbono, por ejemplo algunas membranas celulares, clulas caliciformes en la mucosa del intestino, fibras reticulares que estn rodeados por hidratos de carbono, etc. Entonces en esta tcnica, el cido peryodico oxida a los grupos oxidrilos (OH) de dos carbonos cercanos, formando de esta manera grupos aldehdos compuestos por carbono, oxigeno e hidrogeno. As la leucofucsina puede reaccionar con estos y dejar una tincin rojiza. Fundamento: La tincin PAS (periodic acid-Schiff) es uno de los mtodos qumicos ms empleados en histologa. En la tincin PAS se trata el material con cido perydico, que oxida los 1,2-glicoles formndose grupos aldehdo. Con el reactivo de Schiff, los aldehdos reaccionan dando un color rojo luminoso. Con polisacridos no substituidos, mucopolisacridos neutros, mucoprotenas y glucoprotenas, glucolpidos y fosfolpidos, la tincin PAS da una reaccin de color especfica. Procedimiento: Desparafinar en forma tpica los cortes y rehidratar. Enjuagar en agua destilada. Sumergir las lminas en cido perydico 5 min. Agua corriente del grifo, fluente 3 min. Enjuagar en agua destilada. Reactivo de Schiff 15 min. (el tiempo depende de las condiciones del reactivo de Shiff) Agua corriente del grifo, fluente 3 min. Enjuagar en agua destilada. Diferenciar en hematoxilina 2 min. Agua corriente del grifo, fluente 3 min.

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Resultados:

Ncleos: azul Polisacridos, glucgeno, mucopolisacridos neutros, mucoprotenas y glucoprotenas, glucolpidos, fosfolpidos, membrana basal, colgeno: prpura

Impregnacin de plata (reticulina)

Estas tinciones evidencian las fibras de reticulina y material de membrana basal. Las fibras de reticulina consisten en fibras finas constituidas principalmente por colgeno tipo III, mientras que las membranas basales contienen en gran parte colgeno tipo IV y laminina junto con proteoglicanos que son los responsables de la tincin con sales de plata. Evidencia la desorganizacin arquitectural trabecular y en estudios de mdula sea para poner de manifiesto mielofibrosis incipiente (fibrosis reticulnica) negativa en fases iniciales para tincin de colgeno. Procedimiento: Desparafinar e hidratar las laminas. Lavar a choro de agua. Enjuagar en agua destilada. Sumergir las lminas en ac. Pcrico durante 10min. Lavar con agua destilada. Agregar cido crmico durante 30 min. Lavar con abundante agua destilada. Precipitado de plata durante 30 min a 90C 100C. Dejar a temperatura ambiente asta topar la coloracin naranja. Lavar con agua destilada. Cloruro de oro por 1 minuto. Lavar en agua destilada. Agregar Tiosulfato durante 2 min. Light Green 5min. Lavar en agua destilada. Secar y realizar el montaje.

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Resultados:

Reticulina: negro. Ncleos: grisceo. Colgena: prpura grisceo.

EN CASOS DE AMILOIDOSIS:
AMILOIDOSIS RENAL: La amiloidosis es una enfermedad de etiologa desconocida, que se caracteriza por el depsito de una sustancia amorfa (amiloidea) en los espacios extracelulares de diversos rganos y tejidos, condicionando alteraciones funcionales y estructurales, segn la localizacin e intensidad del depsito. La amiloidosis se caracteriza por el depsito de material proteico autlogo, fibrilar, con estructura molecular terciaria en disposicin B-plegada, responsable de su carcter insoluble y de su resistencia a la digestin proteoltica. Esta sustancia, se caracteriza porque presenta un componente constante, llamado componente P, que deriva de una glicoproteina plasmtica, de sntesis heptica y que forma parte de la familia de las pentraxinas (Amiloide P Srico SAP); y un componente proteico variable que constituye la base para la clasificacin patognica de la amiloidosis; encontrndose tres tipos principales. El primer tipo, tiene una secuencia N-terminal homloga a una parte de la regin variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, se denomina AL y se presenta en la Amiloidosis primaria (AL) y en la asociada a Mieloma Mltiple. El segundo tipo tiene una secuencia N-terminal especfica de una protena no inmunoglobulina denominada protena AA y se presenta en pacientes con Amiloidosis Secundaria (AA).El tercer tipo, se asocia con polineuropata amiloidea familiar, es generalmente una molcula de transtiretina (prealbumina) que tiene una sola sustitucin de aminocido, Amiloide transtiretina (ATTR). CLASIFICACIN: La amiloidosis se puede clasificar en funcin de dos criterios: Por la distribucin de los depsitos amiloides, en formas localizadas y sistmicas. Por la protena fibrilar constituyente, especfica de cada variedad.

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La terminologa utilizada en la clasificacin de la amiloidosis incluye dos letras, la primera es la A de amiloide, y la segunda letra se refiere a la protena fibrilar especfica o a criterios clnicos destacados. Amiloidosis AL2 La amiloidosis primaria o idioptica est formada por el depsito de fibrillas derivadas de fragmentos de la regin variable de las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas en diferentes tejidos. Se incluyen tambin dentro de esta denominacin la amiloidosis asociada al mieloma mltiple (MM) o a otras discrasias de clulas plasmticas. La amiloidosis AL representa la forma ms agresiva de las sistmicas, afectando tpicamente al rin, aparato digestivo, hgado, cpsulas suprarrenales, corazn, articulaciones y sistema nervioso central (SNC) y sistema nervioso perifrico (SNP), provocando diversas alteraciones funcionales relacionadas con la intensidad y localizacin de los depsitos amiloides. Amiloidosis AA Es una amiloidosis secundaria formada por el depsito de la protena amiloide A de estructura no inmunoglobulnica que deriva de un precursor plasmtico de sntesis heptica que acta como reactante de fase aguda, el precursor srico de la protena amiloide A (SAA). Esta amiloidosis es secundaria a procesos crnicos, bien infecciosos bien inflamatorios. Tambin se incluye en este grupo la amiloidosis asociada a la fiebre mediterrnea familiar. Aunque tiene un carcter sistmico la distribucin de los depsitos es ms limitado que en la AL, afectando bsicamente al rin, cpsulas suprarrenales, hgado y bazo. El TNF es un factor patognico importante en el desarrollo de la amiloidosis AA, se cree que interviene en la sntesis heptica del SAA y en el depsito de la sustancia amiloide. Amiloidosis AF El infiltrado es de protenas diferentes respecto a las anteriores. Los principales sndromes clnicos son la Polineuropata Familiar y la Cardiomiopata Familiar Tipo Dans. La afectacin renal no es excepcional, aunque suele presentarse en fases evolucionadas de la enfermedad. Amiloidosis AH En este caso se trata de una amiloidosis provocada por el depsito de -2- microglobulina en pacientes con insuficiencia renal crnica (IRC) sometidos a Dilisis durante muchos aos. No Laboratorio de Anatoma Patolgica Hospital Almanzor Aguinaga Asenjo.

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hay afectacin renal, y sus manifestaciones clnicas pueden ser Sd del tnel carpiano, geodas, fracturas patolgicas, espondilo-artropata destructiva, artropata perifrica.

TINCIONES PARA AMILOIDOSIS: Tincin Rojo Congo.

Fundamento: La molcula de Rojo Congo, dado a su tamao de 21 Armstrong, tiene un tamao similar al de la protena amiloide, el cual es de 19 Armstrong, el componente glcido (asociado a la sustancia P) ser el que actuar en esta reaccin. Por lo tanto, ambas estructuras se unirn a travs de puentes de hidrgeno, entre los grupos Carboxilos (COOH) de la protena amiloide y el grupo Amino (NH2) que se encuentra en la molcula del colorante La segunda teora estudiada, nos dice que la molcula de Rojo Congo se intercala entre protenas adyacentes, las cuales normalmente estaran unidas por puentes de hidrgeno. La molcula de colorante interrumpira estas uniones, creando nuevas uniones de puente de hidrgeno entre el colorante y la protena, estabilizndose de esta forma. La distancia aparente entre protenas adyacentes sera de 4,8 Armstrong Procedimiento:

Desparafinar hasta agua destilada. Rojo Congo durante 1 hora. Enjuagar con agua destilada. Diferenciar en hematoxilina por 1 min. Secar y realizar el montaje.

Resultados:

Amiloide: Rojo ladrillo

Optimizacin.

Amiloide muy claro: aumentar el groso del corte o tiempo de incubacin en el rojo congo alcohlico.

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Tincin cristal violeta:
El cristal violeta presenta la propiedad de metacromasia lo cual al reaccionar con grupos carboxilos de las protenas acumuladas en el caso de amiloidosis y va generar un viraje de violeta a rosa en presencia de estas protenas y fibras. Procedimiento:

Desparafinar Hidratar con agua destilada. Cristal violeta durante 1 hora. Enjuagar con agua destilada. Diferenciar en hematoxilina por 1 min. Secar y realizar el montaje

Resultados:

Amiloide: Rosa

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Protocolo de Histoqumica para Biopsia de Piel
Biopsia de piel.
En una biopsia, un mdico o un cirujano toma una muestra de un bulto, una llaga o un tejido del cuerpo de una persona, para que los expertos puedan examinarla y averiguar qu es exactamente. Los mdicos pueden solicitar biopsias de piel para ayudar a diagnosticar o controlar posibles problemas, como:

Erupciones o afecciones de la piel, como eczemas o psoriasis Infecciones de la piel, por ejemplo, de estafilococos Enfermedades, como cncer Otros problemas mdicos que puedan afectar a la piel, como un trastorno metablico (cuando hay un exceso o una carencia de una hormona o de otras sustancias del organismo)

En una biopsia de piel el mdico extrae un trocito o la totalidad de la zona afectada. Este tejido despus se trata con un producto qumico especial para conservar la muestra y se enva a un laboratorio, donde un experto lo examina bajo el microscopio para determinar qu es. Una vez se sepa esto, el mdico podr darte el tratamiento adecuado.

Tratamiento de la biopsia de peil:

Fijacin: El fragmento obtenido debe ser colocado inmediatamente en el lquido fijador para evitar la autolisis de los tejidos y estabilizar las protenas. El volumen del lquido fijador debe ser 10-20 veces mayor que el del fragmento por fijar.2 Por otra parte, el tamao del frasco en el que se coloque, debe ser lo suficientemente grande, que permita introducir la pieza sin aplastarla o enrollarla. Los tejidos deben ser manejados con suavidad, no pinzarlos para que las estructuras cutneas no se alteren o modifiquen. El dermatlogo debe cerciorarse de que el tejido biopsiado ha quedado dentro del lquido fijador y no adherido a las paredes del frasco o en el sacabocado. Inclusin en parafina para realizar los cortes necesarios. Las laminas deben estar previamente tratadas con solucin de polielilisina para evitar q se desprenda el tejido.

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Tinciones para biopsia de piel:
Tincin Rojo Congo.
Fundamento: La molcula de Rojo Congo, dado a su tamao de 21 Armstrong, tiene un tamao similar al de la protena amiloide, el cual es de 19 Armstrong, el componente glcido (asociado a la sustancia P) ser el que actuar en esta reaccin. Por lo tanto, ambas estructuras se unirn a travs de puentes de hidrgeno, entre los grupos Carboxilos (COOH) de la protena amiloide y el grupo Amino (NH2) que se encuentra en la molcula del colorante La segunda teora estudiada, nos dice que la molcula de Rojo Congo se intercala entre protenas adyacentes, las cuales normalmente estaran unidas por puentes de hidrgeno. La molcula de colorante interrumpira estas uniones, creando nuevas uniones de puente de hidrgeno entre el colorante y la protena, estabilizndose de esta forma. La distancia aparente entre protenas adyacentes sera de 4,8 Armstrong Procedimiento:

Desparafinar hasta agua destilada. Rojo Congo durante 1 hora. Enjuagar con agua destilada. Diferenciar en hematoxilina por 1 min. Secar y realizar el montaje.

Resultados:

Amiloide: Rojo ladrillo

Optimizacin.

Amiloide muy claro: aumentar el groso del corte o tiempo de incubacin en el rojo congo alcohlico.

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Tincin cristal violeta:
El cristal violeta presenta la propiedad de metacromasia lo cual al reaccionar con grupos carboxilos de las protenas acumuladas en el caso de amiloidosis y va generar un viraje de violeta a rosa en presencia de estas protenas y fibras. Procedimiento:

Desparafinar Hidratar con agua destilada. Cristal violeta durante 1 hora. Enjuagar con agua destilada. Diferenciar en hematoxilina por 1 min. Secar y realizar el montaje

Resultados:

Amiloide: Rosa

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Protocolo de histoqumica para Microrganismos Tinciones especiales para microrganismos:
Tincin de plata: Plata metenamina de Grocott: Fundamento:
El cido crmico oxida los polisacridos de la pared celular de hongos, Helicobacter pylori y espiroquetas, a aldehdos y cetonas, los cuales se visualizan por reduccin de un complejo plata-hexamina alcalina. El cromo VI se reduce a cromo III. El aclarado de bisulfito tras la oxidacin quizs incremente el depsito de plata que luego es sustituido por oro.

Procedimiento:

Desparafinar en xilol e hidratar en alcoholes de diferente concentracin hasta agua destilada.

Oxidar en solucin de cido crmico durante 1 hora. Lavar en agua corriente durante 10 minutos. Dejar en solucin de metabisulfito de sodio por 1 minuto. Dejar en agua corriente de 5 a 10 minutos. Dar baos en agua destilada. Colocar en solucin fresca de metanamina (solucin de trabajo) en la estufa a 58C o 60C durante 1 hora, hasta que los cortes se tian de color caf amarillento.

Dar baos en agua destilada. Dejar en cloruro de oro de 2 a 5 minutos. Dar baos en agua destilada. Dejar la solucin de bisulfito de sodio al 2% de 2 a 5 minutos. Lavar en agua corriente. Contrastar con verde brillante de 30 a 40 segundos. Deshidratar en alcoholes, aclarar en xilol y cubrir con resina sinttica o blsamo de Canad.

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Resultados

Hongos, Helicobacter pylori, espiroquetas: color negro Mucina: color gris oscuro. Micelio e hifas: rosado grisceo. Fondo: verde.

Tincin Giemsa:
Estos organismos adquieren una coloracin diferencial y se ven dentro del citoplasma de la clula husped. La tcnica de Giemsa est formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte bsico y la eosina como tinte cido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromtico, de ah que muchas estructuras se tian de prpura y no de azul. El pH de la solucin de coloracin es crtico y se debe ajustar idealmente segn diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9. Procedimiento 1. 2. 3. 4. Desparafinar e hidratar. Aplicar solucin de trabajo de Giemsa durante 10 minutos. Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios. Aclarar con xilol, 3 cambios.

Resultados 1. 2. 3. 4. 5. 6. Citoplasma: rosa Ncleos: azul Eritrocitos: rosa - naranja Grnulos de las clulas cebadas: prpura Bacterias: azul Parsitos: azul

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