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: A
Fecha: 6/5/2005
Servei Central de Suport a la
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Investigaci Experimental
SERVICIO DE SECUENCIACIN-S.C.S.I.E.
UNIVERSITAT DE VALNCIA
CONTENIDOS:
Los tipos de DNA que pueden ser usados como moldes para su
secuenciacin son los siguientes:
Vectores de clonacin:
1.- Vectores de simple cadena: casi todos basados en el bacterifago
M13. Son muy tiles y generan muy buenas secuencias, pero tienen el
inconveniente que slo permiten la secuenciacin en una nica direccin.
2.- Vectores plasmdicos de doble cadena: son los ms utilizados y en
los que centraremos esta gua.
3.- Vectores fagmidos: vectores hbridos, plsmidos de doble cadena
que contienen un origen de replicacin de un bacteriofago de simple cadena.
Si es necesario, vectores del tipo pBluescript y pGem 18/19 pueden
funcionar como fagmidos. Dependiendo de la forma del fagmido se
utilizarn como vectores de doble cadena o de cadena sencilla.
4.- Csmidos, YACs, PACs y BACs: son vectores capaces de replicar
grandes fragmentos de DNA. Son ideales para estrategias de primer
walking.
Fragmentos de PCR:
1.- Productos de PCR de cadena sencilla: producidos a partir de
reacciones de PCR que contienen un exceso de un primer.
2.- Productos de PCR de doble cadena: obtenidos a partir de
reacciones de PCR que contienen cantidades iguales de cada primer.
Se pueden amplificar por PCR fragmentos de DNA a partir de tejidos
o amplificar insertos directamente de colonias. Cuando los fragmentos de
PCR se clonan pueden producirse problemas de errores en la secuencia, que
pueden ser evitados si se realiza la secuenciacin directamente del
producto de PCR, puesto que la tasa de error para cada nucletido es muy
baja y no es detectable en una poblacin grande del fragmento.
Cuando se secuencian fragmentos de PCR es muy importante que los primers
utilizados para amplificar el fragmento sean eliminados eficientemente
antes de la secuenciacin.
Productos de PCR:
o Los productos de PCR deben verse como una nica banda en un
gel de agarosa.
o La secuenciacin de fragmentos de pequeo tamao es algo
problemtica por lo que se recomienda que los productos sean
al menos de 150 pb. Los fragmentos ms pequeos se pueden
comportar como primers y son difciles de purificar con buen
rendimiento.
o Los productos de PCR contienen restos de nucletidos,
primers, dNTPs y enzimas procedentes de la amplificacin que
pueden interferir en la reaccin de secuenciacin. Por este
motivo es necesario incluir un paso purificacin del producto
previo a la secuenciacin. Existen varias opciones y aqu slo
vamos a detallar algunas:
Utilizacin de kits de purificacin directa del producto.
Suelen ser kits de filtracin o mini columnas. Se pueden
utilizar slo cuando el resultado de la amplificacin es
una nica banda.
Purificacin del producto de PCR de un gel de agarosa.
Se trata de correr el producto de PCR en un gel de
Molde Cantidad
Producto de PCR:
100-200 pb 10 ng
200-500 pb 20 ng
500-1000 pb 30 ng
>1000 pb 100 ng
Csmido, BAC 1 g