Western blot

El Western blot, o inmunoblot, es una técnica de laboratorio analítica utilizado para

detectar una proteína específica en una muestra de sangre o tejido; un sistema
rápido y muy sensible para la detección característica de proteínas que se basa en
la especificidad de reconocimiento entre Ag y Ac.

El método implica el uso de electroforesis en gel para separar las proteínas de la

muestra de poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e irreversible a una
membrana, de las proteínas de una mezcla compleja (lisado total celular).

Las proteínas (Ag) separadas se transfieren del gel a la superficie de una

membrana. La membrana se expone a un anticuerpo monoclonales policlonales
específico contra la proteína en estudio. La unión del anticuerpo se detecta usando
un marcador radiactivo o químico.

La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo

que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica
de inmunotransferencia (immunoblotting o Western blot) se puede estimar el tamaño
de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como
la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de
proteína entre muestras.

Procedimiento
a) Preparación de la muestra.
Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción
mecánica o química.

b) Electroforesis en gel de Acrilamida

Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño
mediante electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y
confiere, de forma proporcional a la masa de cada proteína, una carga negativa a
cada una de ellas.

c) Transferencia electroforética a una membrana

Las proteínas son transferidas electroforeticamente a un soporte rígido o membrana,
dónde quedan inmovilizadas.

d) Hibridación del Anticuerpo.

La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas
con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos.
e) Detección de las Bandas.
Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido, se
procede a detectar la localización de la banda en la membrana.

Existen dos métodos para la detección de las bandas

1- Directo:
El anticuerpo primario marcado se une al antígeno de la membrana y reacciona con
el sustrato originando una señal detectable,como un enzima, biotina o molécula
fluorescente. En el método directo de detección, el anticuerpo primario que se utiliza
para detectar el antígeno sobre la superficie de la membrana, debe ir marcado con
una enzima.

2- Indirecto
El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo
secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato. En el método
indirecto, se añade primero un anticuerpo primario sin marcar contra el antígeno de
la superficie de la membrana; posteriormente se añade un anticuerpo secundario
marcado contra el anticuerpo primario. Es decir que en este método se utilizan dos
anticuerpos; un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del
primer anticuerpo.

Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son:

1. Quimioluminiscencia
Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos
secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). La reacción entre el enzima y el
substrato produce luz, que puede ser detectada mediante la exposición de la
membrana a una película de rayos X.
2. Fluorescencia
3. Colorimetría.
Resumen de todo el procedimiento.

Utilidad
Se usa principalmente para determinar la presencia o ausencia de una proteína
concreta en una muestra. También nos puede ser útil para determinar los niveles de
dicha proteína en esa muestra, o el tamaño de esta proteína, ya que en
determinadas enfermedades el problema no es la ausencia total de una molécula
sino su reducción o la expresión de una forma truncada de dicha proteína.
1. Enfermedades Inflamatorias
2. Enfermedades Infecto-Contagiosas
3. Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales
4. Factores de Crecimiento
 5. Proteínas de Secreción
6. Enfermedades Infecto-Contagiosas
7. Enfermedades Inflamatorias
8. Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales
9. Factores de Crecimiento - Proteínas de Secreción
10. Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina,
comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".
11. La enfermedad de Lyme
12. Prueba de VIH

Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el Western Blot se usa
como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo
que no es de riesgo o en una población donde la prevalencia del virus es muy baja.

Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de

suero humano. Se transfieren a una membrana las proteínas de células que, se
sabe, están infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar
con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubación con el anticuerpo
primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos los que realicen el
papel de anticuerpo primario.
Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar
con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-señal. La aparición
de bandas indica la presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente
contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.

Actualmente, el Western Blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la

biología molecular.
Con ella se pueden determinar los niveles de una proteína antes y después de un
tratamiento, su nivel de fosforilación u otras modificaciones post-traduccionales, etc.
 - Aunque los ensayos Western Blot o ELISA estén basados en una
interacción antígeno-anticuerpo y su principal finalidad sea la de detectar una
determinada proteína de forma específica a partir de una muestra, ambos
inmunoensayos presentan marcadas diferencias.

- WESTERN BLOT O ELISA: SIMILITUDES

1. Tanto el Western Blot como el ELISA son inmunoensayos.

2. Ambos métodos están basados en la reacción antígeno-anticuerpo.

3. Son experimentos de naturaleza analítica.

4. Se utilizan para detectar biomoléculas como proteínas, enzimas, hormonas,

etc.

- WESTERN BLOT O ELISA: DIFERENCIAS

1. ANALITO QUE DETECTAN

Western Blot: principalmente antígenos presentes en la muestra.

ELISA: anticuerpos o antígenos presentes en la muestra.

2. TIEMPO DE EJECUCIÓN DEL EXPERIMENTO

Western Blot: alto consumo de tiempo.

ELISA: técnica de ejecución muy rápida.

3. NÚMERO DE MUESTRAS POR EXPERIMENTO

Western Blot: solo pueden analizarse un número muy limitado de muestras por

experimento.

ELISA: pueden analizarse multitud de muestras de manera simultánea utilizando

placas de 96 pocillos, y el uso de lectores de placas permite un screening de alto

rendimiento.

4. CUANTIFICACIÓN DEL ANALITO

Western Blot: es un método semicuantitativo.

ELISA: es un método cuantitativo que permite conocer la cantidad de analito

presente en la muestra de manera precisa.

5. PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS

Western Blot: permite obtener fotografías para presentar los resultados.

ELISA: Los resultados son lecturas numéricas, y no pueden presentarse en formato

de imagen.

6. COMPLEJIDAD DE LA TÉCNICA

Western Blot: técnica relativamente compleja que precisa la estandarización del

proceso completo.

ELISA: técnica más sencilla que puede llevarse a cabo con éxito incluso por

personal menos experimentado.

7. COSTE

Western Blot: Requiere el uso de varios reactivos químicos, geles, etc., que hacen

que el coste resulte elevado.

ELISA: comparativamente, el coste es menor, también debido a la cantidad de

muestras que pueden analizarse en un único experimento.