Técnica de Western Blot

También llamado inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica analítica

usada en biología celular y molecular, aunque no solamente para estos
dominios de la biología específicamente, sino también para la bioquímica, la
biotecnología o la inmunología. Esta técnica sirve para identificar proteínas
específicas en una mezcla compleja de proteínas, por ejemplo las que se
presentan en extractos celulares o tejidos. Western Blot consta de tres etapas,
las cuales son las siguientes: la separación por tamaño, la transferencia a un
soporte sólido y, por último, la visualización o detección mediante la marcación
de proteínas con el uso de anticuerpos, que pueden ser primarios o
secundarios, pero que sean los apropiados para el tipo de muestra con la que
se esté llevando a cabo la muestra.

Pasos para realizar la Western Blot

1. Preparación de la muestra: para esto vamos a necesitar de una pequeña
cantidad de tejido o de un cultivo celular, este se introducirá en una solución
amortiguadora o en un tampón de extracción. Procedemos a
homogenizarlos, si es que se tratasen de volúmenes grandes de muestra, o
centrifugarlos, si se tratasen de volúmenes pequeños de muestra, sin
embargo, no debemos olvidar de que este proceso se debe realizar a bajas
temperaturas (un intervalo de -4°C hasta los -10°C, para que de esta manera
se evite la desnaturalización proteica. Después de esto, se ha de haber
producido lo que nosotros conocemos como “lisis celular”.
 En el presente gráfico, podemos observar cómo es que se prepara la
muestra, aunque podemos objetar el hecho de que la centrifugación y la
homogenización no son los únicos métodos para favorecer la lisis celular.
En el gráfico se pueden apreciar el ácido clorhídrico, que es una solución de
cloruro de hidrógeno en medio acuoso; azul de bromo fenol, que es un
indicador de potencial de hidrogeniones o pH simplemente, un buffer o
amortiguador simple. Y es que claro, también podemos usar los
detergentes, las sales o tampones para favorecer la lisis celular y la
solubilización de las proteínas. En la última imagen podemos apreciar un
tubito de ensayo, después de haber hecho la centrifugación, vamos a
observar básicamente el pellet y el sobrenadante, las proteínas asociadas a

la membrana quedarán en el pellet; mientras que las solubles en el

sobrenadante.
Otra de las maneras en la podemos aislar las proteínas es por medio de
la electroforesis en gel. Se estarán preguntando ¿Qué es eso? La
electroforesis en gel es otra técnica, esta consiste en la separación de
moléculas en base a sus propiedades, como el tamaño, la forma o el punto
isoeléctrico. Ahora, en base a esas propiedades, vamos a separar a las
proteínas. Vamos a recalcar que la EEG más frecuente es conocida como
SDS-PAGE, del inglés sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis o como electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico. En esta se perderán las estructuras tanto secundaria
como terciaria de las proteínas, mas podrán separarse únicamente en
función de su tamaño.
2. Transferencia: Esta etapa se basa en la accesibilidad de las proteínas para
que sean detectadas por anticuerpos, es decir, lo que se busca en esta
etapa es hacer que las proteínas se vuelvan accesibles para su detección en
la última etapa. El resultado de la electroforesis en la etapa anterior se
transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana nitrocelulosa o de
PVDF (fluoruro de polivinilideno) Esta transferencia se puede realizar por
difusión, por vacío o por acción de un campo eléctrico (electrotransferencia).
- Difusión simple: nosotros conocemos lo que es la difusión simple a
través de la membrana, sabemos que es un mecanismo de transporte
activo, por medio de canales. Bueno, en el Western Blot y para ser más
específicos, en la transferencia, lo que va a ocurrir es que se van a poner
 en contacto tanto la superficie de gel electroforético de la membrana y un
taco de papeles de filtro. Este montaje se va a colocar sobre un tampón,
acuérdense que los tampones son soluciones acuosas amortiguadoras o
reguladoras, entonces lo que va a suceder es que este tampón va a
ascender por capilaridad hacia el papel de filtro y arrastrará consigo a las
proteínas.
- Transferencia al vacío: Lo vamos a relacionar con el transporte activo
de la membrana en cierto aspecto, ya que esta consta también de

bombas. En esta técnica, se añadirá lo que viene a ser el poder de

succión de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas
de gel, el cual llevará las proteínas desde el gel hasta la superficie de la
membrana de nitrocelulosa.
- Electrotransferencia: Se basa en una corriente eléctrica y un tampón de
transferencia. Como podemos observar en este gráfico, observamos que
los elementos están apilados del polo negativo o ánodo al polo positivo o
cátodo: Podemos observar el papel filtro, la membrana de nitrocelulosa,
el gel y el papel filtro nuevamente. Entonces, como había mencionado, al
hacer uso de la corriente, este sistema lleva las proteínas desde el gel
hacia la membrana (las proteínas quedan atrapadas en la membrana).
Cabe destacar que la electrotransferencia es la técnica de transferencia
más usada gracias a la velocidad con la que realiza la transferencia de
proteínas y por el porcentaje de proteínas que son transferidas.
3. Visualización y detección de proteínas: Previo a esta última etapa, cabe
destacar que la membrana que observamos después de la
electrotransferencia necesita poder unirse a las proteínas de forma
inespecífica, es por ello que se deben bloquear los lugares de unión que han
quedado libres tras la transferencia. Sino el anticuerpo (de naturaleza
proteica) empleado en la detección puede unirse a ellos, dificultando la
distinción del complejo antígeno – anticuerpo que se forma. Este proceso
previo a la detección de proteínas es conocido como bloqueo, y en bloqueo
se incuban a la membrana soluciones de proteínas, como la albúmina de
suero bovino, la ovoalbúmina, la caseína, etc. La visualización y detección
propiamente dichas comprueban la presencia de una determinada proteína
en la membrana. Para ello se emplea un anticuerpo específico unida a una
enzima que, en presencia de su sustrato, catalizará una reacción
colorimétrica (o sea, producirá color). De esta forma se hace patente (visible,
latente es que existe pero está oculto) la unión del antígeno con la proteína,
así como su localización. Los dos pasos de los que consta la detección son
la unión de un anticuerpo primario y la de un anticuerpo secundario.
- Anticuerpo primario: los anticuerpos son equivalentes a las

inmunoglobulinas, no se vayan a alarmar. En lo único en lo que difieren

es que el primer término hace referencia a la función (anti – cuerpo),
mientras que el término inmunoglobulina hace referencia a la estructura.
Los anticuerpo son producidos por nuestro sistema inmunitario en
respuesta a agentes dañinos a quienes nosotros conocemos como
antígenos. Ahora, en base a esta breve definición de anticuerpo,
podemos decir que si nosotros queremos buscar una proteína, debemos
generar un anticuerpo contra esa proteína. Esto se consigue inoculando
esta proteína que queremos buscar a un cultivo celular, aunque en
laboratorio, muchas veces se involucra a animales. Una vez nosotros
introducimos ese antígeno en el cultivo celular, se deberá desencadenar
una respuesta inmune cuyo resultado incluya la producción del
anticuerpo, primario en este caso, pero ¿por qué? Porque ya se conoce a
la proteína.
 - Anticuerpo secundario: Lo que vamos a hacer ahora es eliminar los
restos de anticuerpos primarios que no se han unido a la membrana y
para ello necesitamos lavar la membrana. Posterior al lavado, se expone
al anticuerpo secundario. Este anticuerpo va a reconocer de forma
específica la región concreta en donde se ha ubicado el anticuerpo
primario. Este tipo de inmunoglobulinas suelen estar marcadas para ser
detectables, en unión a la B8 o biotina, a una enzima reportera como la
fosfatasa alcalina, etc. Entonces varios de estos anticuerpos secundarios
se unirán a cada anticuerpo primario, amplificándose la señal y de esta
manera, reconociéndose la proteína.
Aplicaciones
1. Actualmente, la Western Blot es de las técnicas más usadas en el estudio de
la biología molecular.
2. Como prueba diagnóstica, ratifica la presencia del VIH, aunque por lo
general, acuérdense que el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA
(ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas). Es decir, si una persona
presenta VIH, para verificar que lo presenta se hace un análisis de sangre en
donde se estudia la presencia de justamente lo que hemos venido hablando:
de anticuerpos y antígenos. Si se da positivo por medio de la prueba de
ELISA, pero quieres gastar más dinero porque estás seguro que no tienes
VIH, entonces la prueba con mayor índice de veracidad será la de Western
Blot.
3. En el caso del covid 19, por medio de la Western Blot es que a través del
componente sérico de la sangre es que se detecta la presencia de una
proteína de interés mediante la emisión de un anticuerpo o indicador
coloreado que interactúa con la proteína viral. Cabe mencionar que las
inmunocromatografías, lo que nosotros conocemos como pruebas rápidas,
son solo indicadores. Al igual que en el VIH, la Western Blot sirve como
prueba definitoria ya que es una prueba molecular.
4. En los casos clínicos veterinarios, al igual que en los humanos, servirá como
prueba definitiva tanto de la encefalopatía espongiforme bovina y la FIV en
gatos, la primera es conocida como enfermedad de las vacas locas y es que
básicamente ese son los signos de las vacas, se vuelven locas, el ganado
tiene un modo de andar anormal, hiperactividad, etc. La segunda se
relaciona con la presencia de VIH, pero en los felinos, es el virus de la
 inmunodeficiencia felina. Este tipo de virus difiere de otros dos retrovirus
felinos que por lo general son inocuos, inofensivos, y es que este virus está
más emparentado con el VIH humano, pero no se alarmen, no es
contagioso. Los gatos que desarrollan el mismo cuadro de Sida en humanos
por lo general no mueren por enfermedades oportunistas como si ocurre con
los humanos. Sin embargo, sí son portadores y transmisores de la
enfermedad por muchos años.
Introducción y conclusión
Muy buenas tardes, profesor, compañeros e integrantes del grupo. ¿Cómo
están? Espero que bien. Es de mi agrado informarles que el día de hoy nos
encontramos aquí en pantalla para poder hablarles un poquito más acerca de
un tema que, no solo nos acompañará en biología, sino que tendrá múltiples
aplicaciones a lo largo de nuestra vida. Así es, ¿cómo es que lo adivinaron?
Vamos a hablarles sobre las herramientas moleculares. En esta ppt
encontramos el índice, en el orden en que se hablará, así como en esta ppt se
encuentran los integrantes de este maravilloso grupo. Bienvenidos sean los
compañeros… y quien les habla, les narra, les explica y les comenta: Jesús
Zegarra. Entonces, muchachos, sin más que decir, procedo a cederle la
palabra a mi compañero Andrés Zevallos, quien les comentará acerca de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).