CROMATOGRAFIA

PRINCIPIOS Y APLICACIONES Rafael Gmez-Ullate Ricn Alonso Serrano lvarez

1. Conceptos bsicos sobre cromatografa

Antes de definir los conceptos bsicos para entender los distintos tipos de separaciones cromatogrficas, har una breve introduccin y una explicacin general sobre la cromatografa. Los conceptos que ms adelante se explican se refieren a la cromatografa en columna, sin embargo, es importante sealar que como los equilibrios en los que se basan los dos tipos de cromatografa son idnticos, la teora desarrollada para la cromatografa en columna se adapta tambin fcilmente a la cromatografa plana.

1.1. Breve introduccin a la cromatografa

La cromatografa es un mtodo muy utilizado en todas las ramas de la ciencia y que permite la separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas. Ningn otro mtodo de separacin es tan potente y de aplicacin tan general como la cromatografa.

1.2. Descripcin general de la cromatografa

Es difcil definir rigurosamente el trmino de cromatografa, ya que se ha aplicado ese nombre a varios sistemas y tcnicas. Sin embargo, todos esos mtodos tienen en comn el uso de una fase estacionaria y una fase mvil. En todas las separaciones cromatogrficas, la muestra se desplaza con una fase mvil, que puede ser un gas, un lquido o un fluido supercrtico. Esta fase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o a una superficie slida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario, los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.

1.3. Conceptos bsicos

Cromatograma: Si colocamos un detector al final de la columna que responde a la concentracin del soluto y se registra su seal en funcin del tiempo (o del volumen de fase mvil aadido) se obtiene una serie de picos que representan un grafico denominado cromatograma. Este grafico es til tanto para el anlisis cualitativo como cuantitativo. La posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra; las reas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada componente, (ver Figura 4-1). Tiempo de retencin tR: Es el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que el pico de concentracin del analito alcanza el detector; es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna; es el tiempo que tarda en aparecer el mximo de un pico, (Figura 1-1).

Se representa con el smbolo tR. La velocidad lineal promedio de migracin del soluto v es:

v=

L tR

(1.1)

donde L es la longitud de la columna que esta rellena.

Figura 1-1. Cromatograma caracterstico de una mezcla de dos componentes. El pico pequeo de la izquierda representa una especie que no se retiene en la columna, y de esta forma alcanza el detector casi inmediatamente despus del inicio de la elucin. Por tanto, su tiempo de retencin tM es aproximadamente igual al tiempo que emplea una molcula de la fase mvil para pasar a travs de la columna.

Tiempo muerto tM: Es el tiempo necesario para que la especie no retenida alcance el detector; es el tiempo de migracin de la especie no retenida; es el tiempo necesario para que, por termino medio, una molcula de la fase mvil pase a travs de la columna, (Figura 1-1). De manera semejante la velocidad lineal promedio u del movimiento de las molculas de la fase mvil es
u= L tM

(1.2)

Constante de distribucin: En general, los equilibrios de distribucin implicados en cromatografa se describen por ecuaciones sencillas que suponen la transferencia de una analito entre las fases estacionaria y la mvil. As, para el soluto A, se puede escribir:

Amovil Aestacionaria

(1.3)

La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de distribucin, la razn de distribucin o coeficiente de distribucin, y mide la distribucin del analito entre la fase estacionaria y la fase mvil. Se define como:
K= C C S

(1.4)

donde CS es la concentracin molar del soluto en la fase estacionaria y CM es la concentracin molar en la fase mvil.
CS = moles/Litro de analito en la fase estacionaria. CM = moles/Litro de analito en la fase mvil. Factor de retencin o factor de capacidad:

Es un parmetro que describe la velocidad de migracin de los solutos (analitos) en la columna. Para una especie A, el factor de capacidad kA se define como
kA = K AVS t t kA = R M VM tM

(1.5)

donde KA es el coeficiente de distribucin de la especie A, VS es el volumen de la fase estacionaria y VS es el volumen de la fase mvil. Cuando el factor de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la elucin tiene lugar tan rpidamente que es difcil determinar con exactitud los tiempos de retencin, estos son demasiado cortos. En cambio cuando el factor de retencin es del orden de 20 o 30 o tal vez mayor, los tiempos de retencin son excesivamente largos, (Figura 1-1). Factor de selectivitad: El factor de selectividad de una columna para dos especies A y B se define como:

(t ) t KB k = B = R B M kA KA ( tR ) A tM

(1.6)

donde KB es el coeficiente de distribucin para la especie mas fuertemente retenida B, y KA es el coeficiente de distribucin para la menos retenida, o que eluye con mas rapidez, la especie A. Segn esta definicin siempre es mayor que la unidad, por que B es el compuesto ms retenido (de > tR). donde kB y kB son los factores de capacidad de B y de A, respectivamente. Resolucin cromatogrfica: La resolucin cromatogrfica RS de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos. La resolucin de una columna se define como

2 ( tR ) ( tR ) A 2 Z RS = B RS = WA +WB WA + WB
donde WA y WB son la anchura de los picos A y B.

(1.7)

A partir de la Figura 1-2 se deduce que si R> 1,5 la separacin de los componentes es completa, no ser as si R<1,5. Por lo que para una fase estacionaria dada, la resolucin puede mejorarse alargando la columna, aumentando as el nmero de platos. Aunque una consecuencia negativa del aumento de platos es el incremento del tiempo requerido para la separacin.

Figura 1-2. Separaciones correspondientes a tres resoluciones distintas. Donde, Rs = 2Z/(WA + WB).

Eficiencia en cromatografa: La eficiencia se define en base a dos trminos, que son medidas cuantitativas de la eficiencia de una columna: 1 la altura del plato H y 2 el nmero de platos N. Los dos estn relacionados por la ecuacin:
N= L H

(1.8)

donde L es la longitud (normalmente en centmetros) del relleno de 1a columna. De la ecuacin (1.8) se deduce que la altura del plato H es:
H= L N

(1.9)

La eficacia de la columna cromatogrfica aumenta cuanto mayor es el nmero de platos, y cuanto menor es la altura de plato. Existen diferencias en las eficacias por diferencias en el tipo de columna y/o el tipo de fases mvil y estacionaria. Las eficacias en trminos de nmero de platos varan de cientos a miles, y las alturas de plato de unas pocas dcimas a milsima de centmetro o menos. Existe otra ecuacin para calcular el nmero de platos N:
t N = 16 R W
2

(1.10)

En este caso N se puede calcular a partir de dos medidas de tiempo, tR y W (anchura del pico); para calcular H, se hade conocer tambin la longitud del relleno de la columna L. (Figura 1-3)

Figura 1-3. Definicin del numero de platos N=16(tR/W)2

En general se asume que las bandas cromatogrficas tienen una forma gaussiana, por ello resulta conveniente definir la eficacia de una columna en los trminos de varianza por unidad de longitud de la columna. De esta forma, la altura de plato H viene dada por:
H=

2
L

(1.11)

Esta definicin de la altura de plato se ilustra en la Figura 1-4, donde se muestra una columna con un relleno de L cm. de longitud. En esta figura se muestra una grfica que representa la distribucin de las molculas del analito a lo largo de la columna en el momento en que el pico del analito alcanza el extremo final del relleno (es decir, en el tiempo de retencin tR). La curva es gaussiana, y la ubicacin de L -1 y L +1 se indica mediante lneas verticales discontinuas. Obsrvese que las unidades de L son centmetros y las de 2 son centmetros cuadrados; de este modo H representa una distancia lineal, en centmetros (ecuacin 1-11).

Figura 1-4. Definicin de la altura de plato H=2/L

2. Tipos de separacin cromatogrfica

Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El primero de ellos se basa en la forma en que las fases estacionaria y mvil se ponen en contacto, diferencindose as la cromatografa en columna de la cromatografa en plano o plana. En la cromatografa en columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a travs de la cual hace se pasar la fase mvil por presin o gravedad. En la cromatografa en plano o plana, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la fase mvil se desplaza a travs de la fase estacionaria por capilaridad o por efecto de la gravedad. Nos centraremos principalmente en la cromatografa en columna, y como ya hemos dicho la teora que se desarrolle para la cromatografa en columna se adaptara tambin para la cromatografa plana. Otra clasificacin ms fundamental de los mtodos cromatogrficos se basa en el tipo de fase mvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios implicados en la transferencia de los solutos entre las fases. La Tabla 2.1 da la relacin de las tres clases generales de cromatografa: cromatografa de lquidos, cromatografa de gases y cromatografa de fluidos supercrticos. Como su nombre indica las fases mviles en las tres tcnicas son, respectivamente, lquidos, gases y fluidos supercrticos. Hay que mencionar que solamente la cromatografa de lquidos es la que puede llevarse a cabo en columnas o sobre superficies planas; por otra parte, tanto la cromatografa de gases como la de fluidos supercrticos estn restringidas a los procedimientos en columna, de tal modo que las paredes de la columna contienen la fase mvil.

Tabla 2.1 Clasificacin de los mtodos cromatogrficos en columna Clasificacin general Cromatografa de lquidos (LC) (fase mvil: lquida) Mtodo especfico Lquido-lquido, o reparto Lquido-fase unida qumicamente Lquido-slido, o adsorcin Intercambio jnico Exclusin por tamao Cromatografa de gases (GC) (fase mvil: gas) Gas-lquido Gas-fase unida qumicamente Gas-slido Cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) (fase mvil: fluido supercrtico) Fase estacionaria Lquido adsorbido sobre un slido Especies orgnicas enlazadas a una superficie slida Slido Resina de intercambio inico Lquido en los intersticios de un slido polimrico Lquido adsorbido sobre un slido Especies orgnicas enlazadas a una superficie slida Slido Especies orgnicas enlazadas a una superficie slida Tipo de equilibrio Distribucin entre lquidos inmiscibles Distribucin entre lquido y la superficie enlazada Adsorcin Intercambio inico Distribucin/exclusin Distribucin entre un gas y un lquido Distribucin entre el lquido y la superficie enlazada Adsorcin Distribucin entre el fluido supercrtico y superficie enlazada

3. Cromatografa plana
Los mtodos de cromatografa plana incluyen la cromatografa en capa fina (TLC) y la cromatografa en papel (PC). En todos los casos se emplea una capa plana y relativamente delgada de un material que a su vez es el soporte, o bien que recubre una superficie de vidrio, plstico o metlica. La fase mvil se mueve a travs de la estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o por aplicacin de un potencial elctrico. En la actualidad, la cromatografa en plano se centra en la tcnica de la capa fina, que es ms rpida, tiene mejor resolucin, y es ms sensible que su alternativa en papel. Por ello nos centraremos en los mtodos de capa fina. Las separaciones en capa fina se realizan en placas de vidrio o plstico que se recubren con una capa delgada y adherente de partculas finamente dividas; esta es la capa estacionaria. Las partculas son semejantes a las descritas en cromatografa en columna de adsorcin, de reparto en fase normal y en fase inversa, y las fases mviles tambin son similares las utilizadas en cromatografa de lquidos de alta eficacia en columna. Las placas de capa fina se obtienen de forma comercial. Los tamaos son varios 5X20, 10X20, y 20X20. Estas placas comerciales se presentan en dos formatos. El convencional, donde las placas tienen un espesor de 200 a 250 m un tamao de partcula de 20 m o ms. Presentan por lo comn unos 2000 platos tericos en 12 cm. y con un tiempo de desarrollo de 25 min. El segundo tipo de placas comerciales es el de alta eficacia, que tienen pelculas de unos 100 m de espesor, y un dimetro de partcula de 5 m o menos. El nmero de platos tericos es mayor unos 4000 en 3cm y con 10 min. de desarrollo. Las placas de alta eficacia permiten mejores separaciones y en menos tiempo, pero tienen la desventaja de tener una menor capacidad de carga. La aplicacin de la muestra es el aspecto mas critico de la cromatografa en capa fina. Por lo general, se aplica una disolucin de la muestra del 0,001 al 0,1 %, como una mancha, a 1 o 2 cm. del extremo de la placa. Pero para una separacin de mayor eficacia, la mancha debera tener un dimetro mnimoaproximadamente 5nm para una aplicacin cualitativa y menor para el anlisis cuantitativo, y en el caso de las disoluciones diluidas se realiza tres o cuatro aplicaciones superpuestas secando la zona entre aplicacin. La aplicacin puede ser manual o por aplicadores mecnicos. Si es manual es por contacto entre la placa y un capilar que contiene la muestra, o utilizando una jeringa hipodrmica. En el caso de que sea mecnico, se mejorara la precisin y exactitud de la aplicacin. El desarrollo (Figura 3-1) de la placa es un proceso anlogo a la elucin en la cromatografa de lquidos, en el que la muestra es transportada por la fase mvil a travs de la fase estacionaria. La forma ms comn de desarrollar la placa consiste en depositar una gota de la muestra cerca de unos de los extremos de la placa, y marcar su posicin con un lpiz. Tras la evaporacin del disolvente en el que estaba disuelta la muestra, se coloca la placa en un recipiente cerrado y saturado con los vapores del disolvente con el que se efectuara el desarrollo. Uno de los extremos de la placa se introduce en el eluyente procurando evitar el contacto directo de este con la muestra. El eluyente asciende por la placa gracias el efecto de capilaridad ejercido entre las finas partculas. A medida que el eluyente se desplaza pasa por el punto de aplicacin de la muestra, la disuelve y la arrastra por la placa distribuyndose entre el disolvente que se desplaza y la fase estacionaria. Despus que el disolvente ha pasado a travs de la mitad o las dos terceras partes de la longitud de la placa, se retira esta del recipiente y se seca. Las posiciones de la muestra se pueden determinar por distintos procedimientos. Dos de ellos se usan con la mayora de las mezclas de sustancias orgnicas. Consisten en nebulizar sobre la placa una disolucin de yodo o de cido sulfrico, ya que ambos reaccionan con los compuestos orgnicos para dar productos oscuros. Tambin se utilizan reactivos especficos (como la ninhidrina) para localizar las especies separadas. Otro mtodo de deteccin se basa en incorporar un material fluorescente a la fase estacionaria. Una vez ha finalizado el desarrollo, se examina la placa bajo luz ultravioleta. Los componentes de la muestra amortiguan la fluorescencia del material de tal forma que, toda la placa exhibe fluorescencia menos los lugares donde estn los componentes de la muestra, no fluorescentes.

Figura 3-1. Aspecto ideal que puede presentar una placa tras el desarrollo de la cromatografa en capa fina. La muestra 1 estaba constituida por dos componentes, mientras que la 2 slo por uno.

Existen distintos tipos de anlisis cualitativos para identificar los distintos componentes de la muestra tras realizar la cromatografa en capa fina: Uso de patrones: Consiste en aplicar a la placa la muestra desconocida y disoluciones de muestras purificadas, de las especies que probablemente pueden estar presentes en la muestra desconocida. La coincidencia entre los valores RF de alguna de las manchas de la muestra desconocidas el de alguno de los estndares proporciona evidencias para la identificacin de uno de los componentes de la muestra. RF es un nuevo parmetro denominado factor de retardo, siendo el factor de retardo en la Figura 3-1 para el soluto de la muestra 2. Este mtodo necesita una confirmacin mediante la repeticin del ensayo con diferentes fases mviles y estacionarias y con distintos reactivos de revelado.

RF =

dR dM

(3.1)

Mtodos de elucin: Se raspa la zona de la placa que contiene el analito con una esptula o una navaja, y se recoge el slido sobre un papel satinado. Se trasfiere a un tubo de ensayo u otro recipiente, donde el analito se disuelve con un disolvente adecuado y se separa de la fase estacionaria por centrifugacin o filtracin. La identificacin se realiza por tcnicas como la espectrometra de masas, la resonancia magntica nuclear o la espectroscopia de absorcin en infrarrojo. Cromatografa en plano bidimensional: En este caso la muestra se coloca en una de las esquinas de una placa cuadrada y se realiza el desarrollo en direccin ascendente con el disolvente A. A continuacin se elimina este disolvente por evaporacin, y se gira la placa 90 grados, realizando ahora el desarrollo ascendente con el disolvente B. Tras la eliminacin del disolvente, se determina la posicin de los componentes con un reactivo de revelado, tipo ninhidrina, y las manchas originadas se identifican comparando sus posiciones con las de los estndares, (Figura 3-2).

Figura 3-2. Cromatograma en capa fina bidimensional (gel de slice) de algunos aminocidos. Disolvente A: tolueno/2cloroetanol/piridina. Disolvente B: cloroformo/alcohol bencilico/cido actico. Aminocidos: (1) cido asprtico, (2) cido glutmico, (3) serina, (4) f3-alanina, (5) glicina, (6) alanina, (7) metionina, (8) valina, (9) isoleucina y (10) cistena.

En cuanto al anlisis cuantitativo, ste se puede hacer comparando el rea de la mancha del estndar con la del analito, se puede hacer una estimacin semicuantitativa de la cantidad del componente presente. Los mejores resultados se obtienen si se raspa la mancha de la placa, se extrae el analito del slido que forma la fase estacionaria, y se determina el analito por mtodos fsico o qumicos. Otro procedimiento consiste en usar un densitometro de barrido que puede medir la radiacin emitida de la mancha por fluorescencia o reflexin.

4. Cromatografa en columna
Para poder explicar la cromatografia en columna utilizaremos el concepto de elucin en columna. La Figura 4-1 muestra como dos sustancias A y B se separan en una columna por cromatografa de elucin con una fase mvil. La elucin implica el transporte de una especie a travs fe una columna por la adicin continuada de nueva fase mvil. El proceso empieza cuando una nica porcin de la muestra se introduce en la parte superior de la columna (tiempo t0) despus de lo cual los componente de la muestra se distribuyen entre las dos fases, La introduccin de fase mvil adicional, el eluyente, hace que la fase mvil que la fase mvil que contiene una parte de la muestra avance por la columna, donde tienen lugar una posterior reparto entre la fase mvil y las porciones frescas de la fase estacionaria a las que accede (tiempo t1). Al mismo tiempo, tiene lugar una distribucin entre el disolvente nuevo y la fase estacionaria en el lugar en el que inicialmente se ubicaba la muestra. Las sucesivas adiciones de la fase mvil hacen avanzar las molculas de soluto (analitos) por la columna en una serie de continuas transferencias entre las fases estacionaria y mvil. Sin embargo, debido a que el movimiento de los solutos solo puede ocurrir en la fase mvil, la velocidad media a la que una zona de soluto migra en la columna depende de la fraccin de tiempo que reside en esta fase. Esta fraccin de tiempo es pequea para las sustancias que son retenidas fuertemente por la fase estacionaria (compuesto B) y es grande cuando es ms probable la retencin en la fase mvil (componente A). Las diferencias de velocidad que resultan hacen que se separen los componentes de la mezcla en bandas o zonas, que se localizan a lo largo de la columna (tiempo t2). El aislamiento de las especies separadas se realiza haciendo pasar suficiente cantidad de fase mvil a travs de la columna hasta que las bandas individuales salen de ella, pudiendo as detectarse o reconocerse (tiempos t3 y t4).

Figura 4-1. (a) Diagrama que muestra la separacin de una mezcla de A y B por cromatografa de elucin en columna. (b) Seal de salida del detector en las distintas fases de la elucin mostradas en (a).

Durante la elucin en la columna cromatogrfica de los distintos analitos de la muestra ocurre un proceso asociado y muy importante, la dilucin del analito, proceso que acompaa casi siempre a las separaciones. As el tamao de la banda original que contiene los analitos es notablemente ms pequeo que cualquiera de las zonas que llegan al detector, lo que significa que se produce una importante dilucin de los analitos (su concentracin disminuye) mientras estn siendo separados, (Figura 4-2). Es evidente que el movimiento de avance por la columna aumenta la distancia entre las bandas. Sin embargo, al mismo tiempo tiene lugar un ensanchamiento de ambas zonas, lo que disminuye la eficacia de la columna como sistema de separacin. Existen condiciones en las que se puede lograr que el ensanchamiento de bandas se de mas lentamente que la separacin.

Figura 4-2. Perfiles de concentracin de las bandas de los analitos A y B a dos tiempos distintos en su migracin a lo largo de la columna de la Figura 4-1. Los tiempos t1 y t2 se indican en la Figura 4-1.

La cromatografa en columna es uno de los principales mtodos para la separacin de especies qumicas. Adems, se puede emplear para la identificacin tanto cualitativa como para la determinacin cuantitativa de las especies separadas.

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En cuanto al anlisis cualitativo, la cromatografa proporciona informacin acerca de las especies de la muestra en cuanto a su tiempo de retencin o su posicin en la fase estacionaria tras el periodo de elucin. A pesar de todo la cromatografa no nos aporta mucha informacin de la identificacin positiva de las especies qumicas separadas, pero si que es un buen mtodo para evidenciar la ausencia de ciertos compuestos. La cromatografa en columna es tambin un buen mtodo que proporciona informacin cuantitativa acerca de las especies separadas, basndose en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del analito con la de uno o ms patrones. Pudindose hacer as anlisis cuantitativos basados en la altura del pico, en las reas del los picos, mediante el mtodo de calibrado y patrones, el mtodo del patrn interno, y por ultimo el mtodo de la normalizacin de las reas.

5. Cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC)

5.1. Fundamentos y principios bsicos
El HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY) o Cromatografa liquida de alta resolucin, es una tcnica cromatogrfica usada para separar componentes usando una variedad de interacciones qumicas entre el analito y la columna cromatogrfica. Bsicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fase mvil, bomba, inyector, columna de separacin y detector. El analito se pasa a travs de una columna de la fase estacionaria bombeando la fase mvil liquida con alta presin. La muestra se introduce en pequeos volmenes a la corriente de la fase mvil y all se retarda por medio de interacciones qumicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna. El retardo se conoce como tiempo de retencin, nico para analito. Depende de la naturaleza del analito, de la fase estacionaria y de la composicin de la fase mvil. Los solutos mas comunes usados en la fase mvil son combinaciones de agua purificada con lquidos orgnicos, los mas comunes son Metanol y Acetonitrilo, tambin suelen usarse sales y bufferes para contribuir a la separacin de componentes. Tambin se usa el Acido Trifluoroacetico para actuar como formador de pares inicos. Estas combinaciones introducen el concepto de gradiente de elucin. Consiste en la variacin de la composicin de la fase mvil, para adaptarse a los diferentes analitos y conseguir mejores resultados. El gradiente separa la matriz del analito en funcin de la afinidad del analito por la composicin de la fase mvil. Cada analito tiene un gradiente de elucin ptimo para obtener la mxima separacin de picos en el detector. Existen varios tipos de HPLC: Cromatografa de fase normal: Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basndose en la polaridad. Este mtodo usa una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar que se usa cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorcin aumenta con la polaridad del analito y la interaccin entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elucin. La fuerza de interaccin depende no solo de los grupos funcionales, sino tambin de factores estricos e ismeros estructurales. El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de retencin, mientras que disolventes hidrfobos aumentan el tiempo de retencin. Algunos solutos polares interaccionan con la fase estacionaria y desactivan la columna.

Cromatografa de fase inversa Este tipo de HPLC es el ms comn. En esta tcnica se usa una fase estacionaria no polar y una fase mvil moderadamente polar. La fase estacionaria tpica es silicio tratado con RMe2SiCl, donde R es una cadena lineal con un grupo alcalino.

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La adicin de disolventes polares incrementa el tiempo de retencin y aadir disolventes hidrofbicos lo disminuyen. El tiempo de retencin es mayor para molculas no polares. El principio bsico de este mtodo esta basado en las interacciones del disolvente polar, el analito no polar y la fase estacionaria no polar. Las caractersticas del analito son importantes para sus propiedades de retencin. Las molculas muy grandes pueden causar que la interaccin no sea completa. El tiempo de retencin aumenta con el rea hidrofobicidad, que es inversamente proporcional al tamao del soluto. Los componentes ramificados eluyen ms rpido por que el rea total esta disminuida. Hay otros modificadores de la fase mvil que afectan a la retencin del analito. Aadir sales inorgnicas causa incremento lineal en la tensin superficial de soluciones acuosas, incrementando el tiempo de retencin. El pH tambin es importante porque modifica la hidrofobia del analito. Por eso se suele usar un buffer como fosfato sdico para controlar el pH. Un cido orgnico como cido frmico o cido trifluoracetico. Sirven para muchas cosas, controlan el pH, neutralizan cualquier carga residual del silicato en la fase estacionaria y acta como formador de pares inicos para neutralizar la carga del analito. Los efectos varan pero aumentan la calidad de la cromatografa. Las columnas de fase inversa son ms difciles de daar que las normales. Algunas consisten en silicatos alcalinos y nunca se deben usar con sales acuosas, destruiran el silicato. Pueden ser usados con cidos acuosos, pero no durante mucho tiempo, pueden corroer metal. El metal debe estar en bajo contenido para que la separacin de sustancias sea mejor. Cromatografa de exclusin por tamao: Tambin conocida como cromatografa de gel permeante o cromatografa de gel filtrante. Separa las partculas en funcin del tamao. Es una cromatografa de baja resolucin y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternarias de protenas y es la tcnica comn para averiguar el peso molecular de polmeros sintticos y naturales. Cromatografa de intercambio inico: La retencin esta basada en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Si los iones del soluto y la fase estacionaria tienen la misma carga, son excluidos. Algunos intercambiadores de iones son: Resinas de Poliestireno: permite entrecruzamientos que dan estabilidad a la cadena. Celulosa: Tiene tamao de poros mas grandes y bajas densidades de carga que los hacen ideales para la separacin de protenas. Poro controlado de vidrio o silicona porosa. Los intercambiadores de iones favorecen la unin de iones de mayor carga y radio inferior. Un incremento en el contra-in (con respecto a los grupos funcionales de resinas) reduce el tiempo de retencin. Un incremento del pH reduce el tiempo de retencin en el intercambio catinico, pero bajar el pH reduce la retencin en intercambio aninico. Se usa en la purificacin de agua, preconcentracin de componentes traza, cromatografa de intercambio de ligandos, cromatografa de intercambio de iones de protenas, intercambio de aniones a alto pH de carbohidratos y polisacridos. Cromatografa de bioafinidad: Se basa en las propiedades de sustancias bio-activas para formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de los complejos implica fuerzas moleculares como Van der Waals, electrosttica, dipolo-dipolo, hidrofbicas y puentes de hidrogeno. Una unin bioespecfica se forma por accin simultnea de estas fuerzas en los sitios de unin.

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5.2. Instrumentacin
Bombas: La bomba tiene la funcin de proveer un flujo continuo del eluyente a travs del inyector, la columna y el detector. Los requisitos de una bomba para HPLC son: Rango de flujo: de 0.01 a 10 ml/min Rango de presin: de 1 a 5000 psi Pulsos de presin: menos del 1% para HPLC normal e inverso y menos del 0,2% para el HPLC de exclusin de tamao.

Existen distintos tipos de bombas: De presin constante: son fciles de usar y con bajo mantenimiento, adems evitan los pulsos de presin. El problema es que requiere una vigilancia constante del flujo, puesto que las variaciones pueden producir fallos. De flujo constante: son capaces de mantener el flujo, existen varios tipos: Pistn recproco: un pistn expela lquido a travs de una vlvula anti-retorno. Pistn dual: Usando dos pistones, provee un fllujo constante y libre de pulsos. Desplazamiento positivo (jeringuilla): un pistn controlado por motor que provee un flujo suave y sin pulsos.

Gradiente de elucin: Para crear el gradiente de la fase mvil, es necesaria una mezcla de los componentes. La capacidad de mezcla es vital para obtener el eluyente ptimo. Existen dos mtodos: Mezcla de alta presin: se usan bombas de alta presin individuales para cada lquido. Las salidas se conectan en una camara de mezcla Se usa un controlador electrnico para asegurar que la mezcla es ptima. Mezcla de baja presin: la mezcla ocurre antes de pasar por la bomba, el controlador electrnico regula la cantidad de liquido que pasa por los tubos.

Inyectores: Los inyectores deben introducir muestras liquidas en un rango de volumen desde 0,1 ml a 100 ml con una alta precisin y alta presin. Normalmente se usan inyectores Rheodyne que poseen vlvulas de 6 puertos con un bucle que permite no solo la inyeccin de muestra sino tambin la purga del sistema y la eliminacin de burbujas. Columna: Normalmente compuesta de acero inoxidable del tipo 316, con dimetros internos desde 2,6 a 5 mm, normalmente con filtros de acero poroso. Tubos conectores: Todos aquellos tubos que transportan las sustancias de columna a columna, de columna a detector o de detector a detector. No deben superar los 0,634 mm de dimetro interno o causaran picos en las mediciones.

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Filtros: Situados entre la bomba y el inyector de muestras, para evitar la entrada de ciertas sustancias y evitar el colapso de la columna. Normalmente estos filtros estas compuestos de acero poroso. Medidores de presin: Son indicadores de fallos en el sistema, nos indica cuando un flujo continuo falla por motivos de presin y si existe alguna fuga en la infraestructura del sistema. Termostatos de columna: Son importantes para mantener la columna a una temperatura optima, sobretodo en anlisis cualitativo, puesto que las variaciones de temperatura pueden cambian la viscosidad del eluyente e influir en el volumen retenido. Detectores: De conductividad electroltica: el flujo pasa a travs de un capilar con dos electrodos, la conductividad varia en funcin de la composicin del eluyente y se miden. Muy comn en combinacin con el HPLC de intercambio inico. Electroqumicos: se basa en la reaccin de oxidacin/reduccin del analito con un electrodo, el nivel de reaccin es proporcional a la concentracin de analito, midiendo esto y comparndolo con el electrodo de referencia nos da datos que podemos usar para cuantificar. De fluorescencia: es el detector ms usado y el mas preciso, nos permite hacer un anlisis cualitativo, puesto que las sustancias al ser excitadas con ciertas longitudes de onda, emiten en longitudes de onda en el espectro ultravioleta nicas para cada sustancia. De ndice de refraccin: la deteccin implica la medida del cambio del ndice de refraccin de la columna de eluyente. Se mide la diferencia entre el ndice de refraccin de la fase mvil y la muestra. De luz visible/ultravioleta: el detector es bsicamente un espectrofotmetro que mide el cambio que sufre un haz luminoso al atravesar la muestra, midiendo la absorbancia de las sustancias. De dispersin de luz evaporativa: se nebuliza la muestra de la columna hasta formar un aerosol, despus se vaporiza el disolvente y se forman gotas de soluto, despus la clula de dispersin de luz detecta su composicin.

5.3. Aplicaciones al anlisis de alimentos

Conservantes antioxidantes: se usa el gradiente de HPLC con un detector colorimtrico para medir simultneamente los nueve antioxidantes ms comunes. Anlisis de carbohidratos en bebidas: la adicin de mono y disacridos a bebidas y zumos sirve como propsito de enriquecer el sabor. Para determinar si la cantidad aadida es correcta se miden los azucares usando HPLC de intercambio inico con deteccin de pulso amperomtrico con detectores de refraccin o ultravioletas. Ismeros de carotenoides: el HPLC en combinacin con detectores calorimtricos permite el anlisis de los carotenoides dietticos en tejidos animales y vegetales. Flavonoides y fenoles: en el vino la medicin de estas sustancias permite la determinacin del color, la edad y las variedades de uva usadas. El HPLC en combinacin con colormetros, permiten la determinacin de hasta 22 compuestos diferentes simultneamente.

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Lpidos: la determinacin de lpidos animales y vegetales como: colesterol, triglicridos, glicridos y esteroles, se basa en el uso del HPLC y un detector de Dispersin de Luz Evaporativa (ELS). Acidos lipoico y cido dihidrolipoico en suplementos alimenticios: aun en estudio pero su deteccin combinando HPLC con detectores colorimtricos es importante ya que estos dos compuestos parecen importantes como antioxidantes y reguladores del ciclo celular. Medicin de nutrientes liposolubles en tabletas multivitamnicas: el uso del HPLC permite la deteccin de mltiples vitaminas en alimentos suplementarios para neonatos. 4-Hidroxinonenal y otros aldehdos: se forman como resultado de peroxidacin de lpidos, durante la coccin o podredumbre. Se usa HPLC con detectores de fluorescencia para detectar estas sustancias que son citotxicas. Surfactantes no inicos: la deteccin de estas sustancias es crucial puesto que estn altamente reguladas debido a problemas medioambientales, se usa HPLC combinado con dispersin de luz evaporativa. Carbohidratos simples: usar HPLC con ELSD elimina la necesidad de usar bases fuertes o alto pH, convirtindose en un mtodo no destructivo. Catequinas del t: las catequinas son flavonoles del t, posiblemente anticancergenos. Se usa HPLC con hidrlisis enzimtica para detectar estas sustancias tan beneficiosas. Triglicridos: HPLC con ELSD permite la separacin y caracterizacin de todos los tipos de triglicridos. Contaminantes triptfanos: el HPLC con ELSD y detectores colorimtricos permiten la deteccin de esta sustancia txica proveniente de plaguicidas.

6. Cromatografa de gases (GC)

6.1. Fundamentos y principios bsicos
La idea de esta tcnica se basa en la volatilizacin de la muestra y su posterior inyeccin en la cabeza de una columna cromatogrfica. Para la elucin de la muestra se usa un gas inerte como fase mvil, de esta manera la fase mvil no interacciona con las molculas del analito, simplemente transporta el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): Cromatografa gas-slido (GSC): la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos se produce mediante adsorcin. Cromatografa gas-lquido (GLC): la fase estacionaria son molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un gas inerte. Esta es la que se usa ms ampliamente. GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GC es un sistema compuesto de gas portador, sistema de inyeccin de muestra, columna (generalmente dentro de un horno), y detector.

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6.2. Instrumentacin
Gas portador: Debe ser un gas inerte para evitar que reaccione con el analito o con la columna. Los gases de uso mas comn son helio, nitrgeno, hidrogeno o argn. Se controla su entrada en el sistema mediante manmetros para garantizar un flujo constante y estable. Las presiones de entrada son desde 10 a 25 psi. Sistema de inyeccin de muestra: El analito se inyecta usando una microjeringa en una cmara de vaporizacin instantnea sellada por una junta de silicona (Septum). El analito debe ser introducido en pequeas cantidades para asegurar el mejor anlisis, si la columna es ordinaria el volumen es de unos 20 microlitros; si la columna es capilar el volumen es menor de 10-3 microlitros. Se usan divisores de flujo a la entrada de la columna para desechar analito hasta alcanzar estos volmenes. Las muestra slidas deben introducirse en forma de disolucin, el disolvente se pierde en la cmara de vaporizacin y as no interfiere en la elucin. Columnas y sistemas de control de temperatura: Existen dos tipos de columnas: Empaquetadas o de relleno Tubulares abiertas o capilares (Mas eficaces y rpidas)

La longitud de las columnas es de 2 a 50 metros, de acero inoxidable, vidrio, slice o tefln. Las columnas se enrollan de forma helicoidal para encajar en el horno. La temperatura influye directamente sobre la separacin de los analitos, se necesita una precisin de dcimas de grado. La temperatura depende del punto de ebullicin del analito, as pues se ajusta la temperatura un poco por encima del punto de ebullicin. Si son varios analitos se debe ajustar la rampa de temperatura, que consiste en aumentar la temperatura de forma gradual o por etapas hasta separar los analitos. El problema de subir demasiado la temperatura es que aumenta la velocidad de elucin y tambin aumenta el riesgo de descomposicin del analito. Detectores: Detector de ionizacin de llama: es un quemador de hidrogeno/oxigeno donde se mezcla el eluyente con hidrogeno. En esta cmara se produce una chispa para causar ignicin, los compuestos orgnicos al quemarse se pirolizan y producen iones y electrones, aprovechando que se convierte en conductor se induce una corriente elctrica, para detectar iones desprendidos. Es un detector de masa, puesto que aproximadamente el numero de iones desprendidos es igual al numero de carbonos transformados. Detector de conductividad trmica: se basa en el calentamiento de una resistencia mediante el uso de una corriente elctrica. Esta resistencia tiene una temperatura que depende del gas circundante. La resistencia es un hilo de tungsteno, platino u oro. Detector termoinico: Se usa para compuestos fosforados y nitrogenados, su funcionamiento es parecido al detector de ionizacion de llama, el eluyente se mezcla con hidrogeno y se quema. El gas se pasa alrededor de una esfera de rubidio calentado a 600 C y sometida a 180 V, creando un plasma en el cual se forman gran cantidad de iones que producen una corriente medible, la intensidad es proporcional al numero de iones formados y as determinar la cantidad del analito. Detector de captura de electrones: se basa en la emisin de una partcula por parte de tomos como el 63Ni o tritio, el electrn emitido ioniza el gas portador y emite una rfaga de electrones, esta rfaga es sensible a una corriente elctrica que podremos medir. En el caso de especies orgnicas los electrones son absorbidos, disminuyendo la intensidad de la corriente.

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Detector de emisin atmica: el gas se introduce en un plasma de helio inducido por microondas, la alta temperatura ioniza toda la muestra y se miden los espectros de emisin mediante un espectrofotmetro acoplado al sistema. Columnas: Columnas de relleno: Son tubos de vidrio, metal inerte o tefln de 2 o 3 metros de longitud y 2 a 4 mm de dimetro interno el material de relleno del interior consiste en partculas esfricas para interaccionar con el analito. Normalmente se usan diatomeas puesto que es un material ideal para la adsorcin. Columnas capilares: o WCOT: Pared recubierta: son tubos capilares donde la pared interna esta recubierta con una fina capa de fase estacionaria. Son mas eficaces. o SCOT (soporte recubierto): tienen una capa en su lado interno de superficie adsorbente donde se acopla la fase estacionaria. Tienen mayor capacidad de carga.

Fase estacionaria: Una fase estacionaria liquida inmovilizada requiere: Caractersticas de reparto. Baja volatilidad. Baja reactividad. Estabilidad trmica.

Algunos de las fases estacionarias mas comunes son: Polidimetilsiloxano: fase no polar de uso general para hidrocarburos, drogas y esteroides. Poli(fenilmetidifenil)siloxano: para steres metlicos de cidos grasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados. Poli(fenilmetil)siloxano: drogas, esteroides, pesticidas y glicoles. Poli(trifluoropropildimetil)siloxano: para aromticos clorados, nitroaromticos, bencenos alquilsustituidos. Polietilenglicol: para compuestos como glicoles, alcoholes, eteres y aceites esenciales. Poli(dicianoalildimetil)siloxano: para cidos grasos poliinsaturados, cidos libres y alcoholes.

6.3. Aplicaciones al anlisis de alimentos

Caracterizacin de aceites esenciales: se basa en la deteccin de sustancias terpenicas responsables de propiedades aromticas en los alimentos. Anlisis de nitrosaminas en agua potable: las nitrosaminas son sustancias carcingenas potenciales, se debe controlar su presencia en agua potable. Para esto se usa extraccin de la fase slida y GC con columna capilar. Controles de alcoholemia: la GC se puede usar para determinar el volumen de alcohol en sangre. Determinacin de trazas de pesticidas organo-fosforicos (OPP) en aceite de oliva: el GC en combinacin con los detectores de ionizacin de llama permiten la deteccin de estos pesticidas, que a pesar de ser baratos y de amplio espectro, son causantes de problemas irreversibles en la actividad de los neurotransmisores. Contaminacin por dioxinas: usando detectores de conductividad electroltica, permite el anlisis de residuos de dioxinas muy perjudiciales para la salud humana. Deteccin de pesticidas en aves y peces: se usan columnas capilares para la deteccin de pesticidas voltiles o sustancias de vertidos txicos.

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Bibliografa
1. 2. Skoog, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Anlisis Instrumental, Madrid: McGraw-Hill. Mc Master, Marvin (1994) HPLC: A Practical User's Guide. Wiley-VCH.

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