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1.2. Proceso general de una cromatografía de elución: En la figura se muestra cómo dos
sustancias A y B se separan en una columna por cromatografía de elución, que implica el
transporte de una especie a través de una columna por adición continuada de fase móvil:
Al introducir una porción de
mezcla en la parte superior de la
columna (t0) los dos componentes de
la muestra se van distribuyendo entre
las dos fases a medida que el eluyente
va a haciendo que la muestra avance
por la columna repartiéndose entre la
fase móvil y la fase estacionaria.
La velocidad a la que una zona de
soluto migra en la columna depende
de la fracción de tiempo que reside en
esta fase, que es mayor a mayor
retención, haciendo que se separen los
componentes en bandas (t3 y t4).
2.1. Coeficiente de distribución (K): Un soluto establece un equilibrio entre la fase móvil y
la fase estacionaria, con una constante denominada constante, coeficiente o razón de
distribución:
[𝐴]𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎 𝑐𝑠
𝐴𝑚ó𝑣𝑖𝑙 ⇄ 𝐴𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎 𝐾= = (1-1)
[𝐴]𝑚ó𝑣𝑖𝑙 𝑐𝑚
A aquellas cromatografías donde el valor de K es constante en un amplio intervalo de
concentraciones se les denomina cromatografías lineales y en ellas los picos son gaussianas
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simétricas características y los tiempos de retención son independientes de la cantidad del
analito inyectado.
2.2. Tiempo de retención y velocidad lineal promedio: Al tiempo que transcurre desde que
se inyecta la muestra hasta que el pico de
concentración del analito alcanza el detector
se le llama tiempo de retención (tR). Si una
especie no se retiene nada por la fase
estacionaria tardará en recorrer la columna
lo mismo que la fase móvil, y aparecerá un
pico que se denomina tiempo muerto (tM).
De esta forma podemos definir dos valores de velocidad:
- Velocidad lineal de la fase móvil (flujo cromatográfico): Se calcula como la longitud
de la columna dividida entre el tiempo muerto:
𝐿 (1-2)
𝑢=
𝑡𝑀
- Velocidad lineal de migración del soluto: Se calcula como la longitud de la columna
dividida entre el tiempo de retención:
𝐿
𝑣̅ = (1-3)
𝑡𝑅
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Si el factor de retención es mucho menor que la unidad, la elución tiene lugar tan
rápidamente que no se pueden determinar con exactitud los tiempos de retención. En cambio,
si el factor de retención es superior a 20, los tiempos de retención son excesivamente largos.
Lo ideal es trabajar con factores de retención comprendidos entre 2 y 10.
Ya se ha citado que los picos cromatográficos tienen forma gaussiana pero que a veces se
produce un ensanchamiento de banda que dispersa el pico, haciendo incluso que dos picos
puedan solaparse. Para cuantificar este proceso aparece el concepto de eficacia. Un proceso
es tanto más eficaz cuanto más estrecho sea el pico, por lo que será importante la varianza
(σ2) que viene de la desviación estándar (σ).
Para describir la eficacia de una columna hay dos teorías:
3.1. Teoría del plato: Esta teoría usa dos parámetros que son la altura de plato, H, y el
número de platos, N. La eficacia de la columna es mayor al aumentar el número de platos o
al disminuir la altura de plato.
- Altura del plato: Se define la altura de plato como el cociente entre la varianza y la
longitud de la columna:
𝜎2
𝐻= (1-9)
𝐿
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Sin embargo, el número de platos, también
se puede determinar a partir de la siguiente
expresión cuyos datos se pueden obtener
estudiando el cromatograma:
𝑡𝑅 2
𝑁 = 16 ( ) (1-11)
𝑊
3.2. Teoría cinética de la separación: Esta teoría justifica el ensanchamiento de pico de una
manera mecanicista. Según esta teoría, la altura de plato puede determinarse mediante una
expresión matemática conocida como ecuación de van Deemter:
𝐵 𝐵
𝐻 = 𝐴 + + 𝐶 · 𝑢 = 𝐴 + + (𝐶𝑆 + 𝐶𝑀 ) · 𝑢
𝑢 𝑢
(1-12)
A = Camino múltiple de flujo
B = Difusión longitudinal
C = Transferencia de masa entre las fases
(desdoblado en dos coeficientes, uno para la fase
estacionaria y otro para la fase móvil).
Se puede representar la gráfica de van Deemer como la suma de las gráficas de los tres
parámetros anteriores:
En esta gráfica se aprecia como
H pasa por un valor mínimo (o
máxima eficacia) a bajos
caudales, sin embargo, en
cromatografía de líquidos el
mínimo se da a caudales
bastante más bajos que en la
cromatografía de gases. Esto
significa que la separación por
cromatografía de gases se
completa en tiempos menores
que en la de líquidos. Además,
la altura de plato en
cromatografía de líquidos es
menor que en cromatografía de
gases. Esto se contrarresta con el tamaño de las columnas, que es mucho mayor en
cromatografía de gases. Como consecuencia, el número de platos, y por lo tanto la eficacia
de la columna son superiores en la cromatografía de gases.
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La expresión matemática de la resolución es:
∆𝑍 2∆𝑍 2[(𝑡𝑅 )𝐵 − (𝑡𝑅 )𝐴 ]
𝑅𝑠 = = = (1-13)
𝑊𝐴 𝑊𝐵 𝑊𝐴 + 𝑊𝐵 𝑊𝐴 + 𝑊𝐵
+
2 2
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valores de k´ mayores de 10 no son útiles porque no mejoran la resolución y presentan
tiempos de retención largos. Los valores óptimos de k´ deben estar entre 1 y 5.
Con fases móviles gaseosas, k´ puede mejorarse aumentando la temperatura; con fases
móviles líquidas, se suele hacer variando la composición del disolvente.
- Variación del factor de selectividad: Para modificar el valor de α existen varias
opciones, de mayor a menor importancia: Cambiar la composición de la fase móvil,
cambiar la temperatura de la columna, cambiar la naturaleza de la fase estacionaria o
utilizar efectos químicos especiales.
4.2. El problema general de la elución: Como el tiempo de retención de cada especie que
se quiere separar en un cromatograma depende del coeficiente de distribución, se podría dar
el caso que unas especies que forman parte de la mezcla tuvieran un pico óptimo que
permitiera su separación, pero para otras especies no ocurriera lo mismo. Si se cambian las
condiciones, podría darse el caso de que la separación fuese óptima para otras especies, pero
no para las primeras. Esto se muestra en la figura adjunta.
A este problema que puede aparecer frecuentemente en cromatografía se le llama
problema general de la elución y se puede solucionar modificando las condiciones que
determinan los valores de k´
mientras tiene lugar la separación.
En cromatografía de líquidos
las variaciones de k´ se obtienen
por variaciones en la composición
de la fase móvil durante la elución
(elución con gradiente o
programación del disolvente). En
cromatografía de gases se obtiene
mediante el incremento de la
temperatura (programación de la
temperatura).
5. Aplicaciones de la cromatografía
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especies, sí que sirve para asegurar la ausencia de ciertos compuestos (si no aparece un pico
en las mismas condiciones que el patrón, ese componente no está en la mezcla).
5.2. Análisis cuantitativo: Se basa en el estudio de la altura o del área del pico del analito.
- Análisis basados en la altura del pico: Se obtiene uniendo las líneas base a cada lado
del pico por una línea recta y midiendo la distancia vertical al pico. Sin embargo, hay
que tener en cuenta que la altura disminuye con el ancho de banda, por lo que solo se
obtienen resultados exactos si no se altera la altura del pico. Por eso se deben controlar la
temperatura de la columna, el caudal del eluyente y la velocidad de inyección de la
muestra.
- Análisis basados en las áreas de los picos: Son un parámetro más adecuado que las
alturas de los picos, aunque las alturas de los picos se miden más fácilmente y para picos
estrechos se determinan con mayor exactitud. Los aparatos modernos tienen
integradores; si no los tienen, se debe realizar el cálculo manualmente.
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Cuestiones teóricas del tema 1
(Se ha respetado la numeración del libro de texto)
26. 1- Definir:
a) Elución: Es el transporte de una especie a través de una columna por la adición
continuada de nueva fase móvil.
b) Fase móvil: Es un gas, un líquido o un fluido supercrítico que se hace pasar a través
de una fase estacionaria, con la que es inmiscible y en cuyo seno se mueven más
lentamente aquellos componentes que se quedan retenidos por la fase estacionaria,
produciéndose así su separación.
c) Fase estacionaria: Es la fase fija de una cromatografía, que puede ser un líquido
adsorbido sobre un sólido, especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida,
sólidos, resinas de intercambio iónico, etc. Es inmiscible con la fase móvil y tiene la
capacidad de frenar el avance de determinados componentes cuando la fase móvil se
desplaza sobre ella, facilitando así su separación.
d) Coeficiente de distribución (K): Es el cociente entre la concentración de soluto en la
fase estacionaria y la concentración de soluto en la fase móvil:
𝐶𝑆
𝐾=
𝐶𝑀
Aquella cromatografía en la que es aplicable la ecuación anterior se llama
cromatografía lineal, y en ese caso, los picos son gaussianas simétricas características
y los tiempos de retención son independientes de la cantidad de analito inyectado.
e) Tiempo de retención (tR): Es el tiempo que transcurre desde que se inyecta la muestra
hasta que el pico de concentración del analito alcanza el detector.
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Donde KA es el coeficiente de distribución para la especie menos retenida (la que
eluye con mayor facilidad) y KB es el coeficiente de distribución para la especie más
retenida (la que eluye con mayor dificultad). Según esto, el valor de α es siempre
mayor que la unidad.
h) Altura de plato (H): Se define como el cociente entre la varianza y la longitud de la
columna, siempre que se asuma que las bandas cromatográficas tienen una forma
gaussiana:
𝜎2
𝐻=
𝐿
Supongamos que tenemos una columna con un
relleno de L centímetros de longitud. El pico
de salida es una curva gaussiana y en él se
pueden señalar los puntos L – σ, L y L + σ. En
ese caso puede definirse altura del plato como
la longitud de la columna que contiene la
fracción de analito comprendida entre L – σ y
L (que corresponde aproximadamente a un 34
% del analito).
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l) Eluyente: Es la fase móvil adicional que se añade a la columna después de introducir
la muestra con el analito a separar y que es la responsable de que la muestra discurra a
través de la columna y se produzca un reparto entre la fase móvil y la fase
estacionaria.
26.8. Describir un método para la determinación del número de platos de una columna.
A partir de la expresión:
𝑡𝑅 2
𝑁 = 16 ( )
𝑊
Teniendo el tiempo de retención de la especie y la anchura del pico (W), se puede
determinar el número de platos de la columna.
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26.20. Enumerar las variables que conducen (a) al ensanchamiento de banda y (b) a la
separación de las bandas.
Para el ensanchamiento de banda son las siguientes: Velocidad lineal de la fase móvil,
coeficiente de difusión en la fase móvil, coeficiente de difusión en la fase estacionaria, factor
de retención, diámetro de la partícula de relleno y espesor del recubrimiento líquido en la
fase estacionaria.
Para la separación de bandas son cuatro factores: Número de platos, altura del plato, factor
de retención y factor de selectividad.
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