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Cromatografia Principios y Aplicaciones

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CROMATOGRAFÍA PRINCIPIOS Y APLICACIONES

ANÁLISIS QUÍMICO
Prof. Manuel Chicharro 1º Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Ana Isabel Bautista Alicia Benayas Yolanda Alicia Ortiz

ÍNDICE
1. Conceptos básicos sobre cromatografía..................................... 1.1 Introducción................................................................. 1.2 Base científica.............................................................. 1.3 Terminología en cromatografía.................................... 3 3 4 4

2. Cromatografía plana y en columna……………………………. 7 2.1 Cromatografía en papel……………………………….. 7 2.2 Cromatografía en capa fina…………………………… 7 2.3 Cromatografía en columna……………………………. 11 3. Cromatografía Líquida de Alta Resolución. HPLC…………… 3.1 Fundamentos y principios básicos…………………… 3.2 Instrumentación………………………………………. 3.3 Aplicaciones al análisis de los alimentos…………….. 13 13 16 18

4. Cromatografía de gases………………………………………… 19 4.1 Fundamentos y principios básicos……………………. 19 4.2 Instrumentación………………………………………. 19 4.3 Aplicaciones al análisis de los alimentos……………... 21 Bibliografía………………………………………………………...22

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1. CONCEPTOS BÁSICOS SOBRE CROMATOGRAFÍA
1.1 INTRODUCCIÓN
La cromatografía es una técnica que se emplea para separar entre si los componentes de una sustancia. Esta técnica fue creada por el botánico ruso Michael Tswett en 1906, el cual llamó a su método cromatografía, palabra griega que significa escritura a color, porque lo utilizo para separar compuestos coloreados. Tswett llevó a cabo una extracción de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando éter de petróleo, un disolvente no polar, y descubrió que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto a través de una columna, un tubo de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza).Tswett utilizó como detector del experimento la simple observación, ya que los compuestos que separó tenían color y era posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos que se encuentran en las hojas de las plantas. A pesar de que el método cromatográfico prometía simplificar la separación de sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la década de los 30 y principio de los 40 cuando se empezó a desarrollar la técnica teniendo este método diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografía se emplea principalmente para separar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier técnica que se base en los mismos principios. La columna sencilla de Tswett, un tubo vertical de cristal, abierto por su parte superior, rellena de un sólido común donde el eluyente se mueve conducido por su propio peso, ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy conocemos (fig1).

Fig. 1. Cromatógrafo de gases con espectrómetro de masas

Fig. 2. Equipos para HPLC (C. de alta resolución para líquidos)

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1.2 BASE CIENTÍFICA
En la cromatografía se separan los componentes de las mezclas a medida que son transportadas por un fase fluida móvil a través de una fase estacionaria sólida o líquida, la separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y esta separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox… Como resultado hay una gran variedad de técnicas para llevar a cabo la separación de una sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos según el mecanismo de separación: • C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad. • C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción. • C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular. • C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica. También se pueden clasificar según el estado de la fase móvil en : • C. de gases: la fase móvil es un gas y pueden ser dos sistemas: o C. gas-liquido o C. gas-sólido • C. líquida: la fase móvil es un liquido y puede ser: o C. liquido-liquido o C. liquido-sólido o C. de exclusión o C. de intercambio ionico Las únicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografía son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria. Dentro de las técnicas cromatográficas no se incluyen los métodos que utilizan campos eléctricos para separar moléculas cargadas, métodos que se denominan electroseparaciones, electromigraciones o electroforesis. El proceso cromatográfico, aparentemente simple, es en realidad una compleja unión de fenómenos tales como hidrodinámica, cinética, termodinámica, química de superficie y difusión. Hasta la fecha se han propuesto muchas teorías, que incluyen complejos matemáticos para poder explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatográficas, por citar alguna de estas teorias las más estudiadas son: ! Teoría de los Platos Teóricos (Martin & Synge). ! Teoría Cinética (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer). ! Teoría Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).

1.3 TERMINOLOGÍA EN CROMATOGRAFÍA
" Absorción: es la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o a reaccionar químicamente con la misma.

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" Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorción y de reparto. " Adsorción: Es la retención de una especie química en los sitios activos de la superficie de un sólido, quedando limitado el fenómeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta retención superficial puede ser física o química. " C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. " C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar. " Disolvente o revelador: Cualquier fase móvil. " Elución: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria. " Eluyente: La fase móvil una vez que se extrae de la columna. " Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna cromatográfica durante la cromatografía y que retiene algún componente de la muestra, posee una gran área superficial y puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido que actúa como soporte. " Fase móvil: Es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que se usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a través de la columna cromatográfica y la fase estacionaria. " Origen: Lugar físico donde se coloca la muestra al principio. " Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografía. " Soporte: El material sólido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la fase estacionaria líquida en su sitio. " Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

Cromatograma
Además de observar el resultado final del proceso, se pueden realizar las medidas continuamente para obtener una información global del proceso pasando la muestra a través de un detector instrumental, normalmente los transductores del detector se sitúan al final de la columna. El detector registra los cambios que se producen en alguna propiedad del eluyente que pasa por él, estos cambios son reproducidos y registrados en forma de gráfica, ésta gráfica que recoge la respuesta del detector en función del tiempo se denomina cromatograma. En las graficas se observa la aparición de una serie de picos a lo largo del tiempo, generalmente la respuesta del detector es linealmente proporcional a la concentración de analitos en la fase móvil, la forma de cada pico muestra la distribución de concentración del componente asociado a dicho pico. En el cromatograma el eje horizontal corresponde al volumen, o al tiempo equivalente. En la cromatografía moderna es frecuente mantener constante la velocidad de flujo (volumen/tiempo), así mediante esta relación se puede reflejar el tiempo en el eje horizontal: velocidad de flujo x tiempo = volumen

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Cromatograma obtenido de la secuenciación de un fragmento de ADN

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2. CROMATOGRAFIA PLANA Y CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
La cromatografía líquida puede llevarse a cabo por cuatro técnicas analíticas: • • • • C. En papel C. En capa fina C. en columna C. Líquida de alta resolución – HPLC –

2.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL
Es una forma combinada de cromatografías de partición y adsorción en la que la fase estacionaria es el agua absorbida presente en el papel, y el soporte es el papel mismo. La fase móvil es una solución que consiste de un solvente o de una mezcla de varios líquidos, incluyendo el agua. Se deja secar sobre el papel unas gotas del extracto de la muestra y se forma una mancha. Para impedir la evaporación, el papel se cuelga dentro de una cámara de tal forma que la mancha pueda ser irrigada con la fase móvil ya sea hacia abajo por efecto de la gravedad, hacia arriba u horizontalmente por efecto de la capilaridad. Cuando la fase móvil ha saturado el papel hasta una distancia predeterminada en la que se logre la separación cromatográfica, se saca el papel de la cámara y se desarrolla el cromatograma rociando agente reveladores. En el caso de sustancias coloreadas tales como los colorantes de alimentos, la separación resulta evidente aun sin la ayuda de tales agentes. Las sustancias no polares también pueden separarse recubriendo el papel con un compuesto no polar y usando solventes polares como fase móvil. Es una técnica barata pero relativamente lenta, con limitaciones en el uso de agentes reveladores, algunos de los cuales pueden atacar y destruir el papel. Las manchas tienden a ser difusas.

2.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)
Es un procedimiento rápido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para identificar/caracterizar o para determinar semicuantitativamente componentes individuales. La separación se basa en que las sustancias investigadas se reparten de modo diferencial entre una fase estacionaria y otra móvil: en la TLC el eluyente (fase móvil) se desplaza por una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando así los componentes individuales de la mezcla de sustancias más o menos lejos dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorción. Al contrario, que en la cromatografía en columna, el proceso separativo transcurre en un sistema abierto, la 7

placa separativa plana. El recorrido particular de cada sustancia se emplea así para su identificación. Las separaciones se realizan generalmente por el “procedimiento ascendiente”, introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el solvente, que será succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la placa.

Aparatos y materiales. Generalidades
- Cubeta cromatográfica (con tapa hermética); la mayoría de las veces se trata de la cubeta “Normal” (profundidad del espacio para el gas: 3mm) - Placas de cromatografía: preparadas por uno mismo o ya fabricadas. - Pipetas de microlitro - Recipiente de vidrio con pulverizador - Probeta o matraz Erlenmeyer con tapón (para preparar y mezclar la fase móvil) - Secador - Plantilla para TLC o regla - En caso necesario: lámpara UV para comprobar la fluorescencia o la disminución de la misma.

Placas cromatográficas y sorbentes
Las placas constan de un soporte liso, inerte (placas de vidrio, láminas de aluminio o de fibra) sobre las que se dispone el sorbente formando un espesor lo más homogéneo posible (por lo general 0,25 mm); dependiendo de la separación a realizar, se tratará de silicagel, óxido de aluminio, poliamida, celulosa, etc o mezclas. En tanto que en el HPLC se utilizan principalmente materiales de fase inversa, en la cromatografía en capa fina predominan los materiales para fase normal, como por ejemplo el silicagel. Hay placas de TLC que tienen la denominada zona de concentración (=zona de carga). Se trata de una zona de unos 2 cm de anchura de barro de diatomeas o de un gel de sílice de tamaño de poro muy grande, de manera que durante el desarrollo de la placa de TLC en esa zona prácticamente no hay separación cromatográfica. La ventaja específica es que los componentes cargados se concentran en una estrecha banda en la línea de partida (línea divisoria entre la zona de concentración y sorción). Así resulta posible cargar grandes volúmenes y obtener una buena separación.

Carga de las disoluciones
Las disoluciones de la muestra y de los patrones se cargan con pipetas de microlitro (o similares) sobre la placa de TLC, de manera que el punto medio de la mancha esté a 1.5 cm aproximadamente del borde inferior y de los bordes de los laterales y que haya una separación entre 1-2 cm de una mancha a otra (Fig: A).

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F 2 3 7 6
p¹ p²

5 l L

S
2cm

1 2 3 4 5 6 7
1,5 cm

1 4 l S

FIG A

FIG B

A. Placa de TLC antes de su desarrollo : carga S=línea de partida, P=muestra (V >V ; V es el volumen p¹ p² cargado. 1-7 patrones B. Placa de TLC después de su desarrollo: cálculos. F(frente del disolvente); l recorrido del disolvente(unos L 13 cm, l S recorrido del componente l.

CARACTERÍSTICAS DE LOS SORBENTES ELEGIDOS PARA TLC

TAMAÑO

SILICAGEL

OXIDO DE ALUMINIO

ANCHURA DE PORO MEDIA -PARA CASOS ESPECIALES TAMBIÉN SUPERFICIE ESPECÍFICA

6 nm 4, 10,15 nm 500 m²/g

6 nm 9, 15 nm 200 m²/ g

VOLUMEN DE PORO ESPECÍFICO

0,75 ml / g

0,2 ml / g

TAMAÑO DE GRANO - PARA HPTLC

12 µm aprox. 5 µm aprox.

12 µm aprox.

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Los volúmenes recomendables dependen de la concentración de las disoluciones. Por lo general, se cargan 1-10 microgramos de sustancia por mancha. Si la concentración de la sustancia a analizar fuera de un orden de magnitud desconocido, la muestra debería cargarse varias veces en volúmenes crecientes y claramente diferentes. Los volúmenes mayores se cargan en varias veces, secando entre una y otra (con aire frío o caliente, aire a presión o con nitrógeno), para evitar que las manchas se extiendan. Para realizar determinaciones cuantitativas con placas convencionales, se cargan volúmenes aproximados de 0.5-1.0 microlitros por mancha. Los volúmenes mayores de 5.0 microlitros deben evitarse salvo en casos excepcionales, donde se cargaran en varias veces.

Desarrollo
El eluyente, cuya composición depende de cada problema concreto, se pone en la cubeta cromatográfica por lo menos 30 minutos antes del principio de la separación hasta una altura de 0.5 cm. La cubeta se cerrará con su tapa para que se sature con los vapores del disolvente y se coloca en un lugar adecuado. Para que la saturación sea mejor, se recubre la cubeta con papel secante (se indicará en el protocolo en el caso que sea necesario). Para desarrollar la placa, su extremo inferior se introduce en el diluyente y se vuelve a cerrar la cubeta inmediatamente. Para evitar eluciones, las manchas cargadas deberán estar completamente por encima del nivel de eluyente. El eluyente se ve impelido hacia arriba por capilaridad a través del recubrimiento. El recorrido será, dependiendo de la separación, de 5 a 15 cm máximo, y el tiempo necesario dependerá del sorbente, del espesor del mismo y de la composición del eluyente. El recorrido óptimo es por lo general de 10 cm.

Cálculos
Tras el desarrollo del cromatograma, se saca la placa de la cubeta y (después de marcar el frente) se seca cuidadosamente al aire o con un secador. La posición de las manchas se determina: -por su color propio -por su fluorescencia -por la disminución o amortiguación de la fluorescencia -por reacción química: la placa una vez seca se rocía parcial o totalmente con un determinado reactivo, de manera que aparecerán coloraciones características o una fluorescencia particular. La identificación de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color y del denominado valor rf (factor de retención , llamado también factor Rf o hRf (=Rf x 100), es decir, el cociente entre el recorrido de la sustancia (ls) y el del eluyente (lL).

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ls [cm] rf =  lL[cm] Para conseguir la identificación, los colores propios o consecuencia del revelado y los rf se comparan con los de sustancias de referencia, obtenidos en las mismas condiciones de desarrollo y tinción (si es posible en el mismo cromatograma). Como control se realizan adicionalmente los denominados cromatrogramas mixtos (la disolución problema y la de la sustancia de referencia se cargan en una misma mancha).

Cromatografía bidimensional en capa fina
Para mejorar una separación incompleta, se combinan dos pasos de cromatografía monodimensional de la manera siguiente: 1º paso: cargar la muestra en una esquina de la placa y desarrollarla en sentido ascendente como se describía más arriba. 2º paso: girar 90º la placa desarrollada y seca, de manera que la mezcla ya separada parcialmente se encuentre en el borde inferior, a continuación se desarrolla en sentido ascendente con un segundo eluyente. La investigación y la determinación se realizan como ya han sido descritas anteriormente.

Aplicaciones
En la mayoría de los casos la TLC se realiza cuando se quieren hacer evaluaciones cualitativas rápidas (screening). Las determinaciones cuantitativas son posibles por acoplamiento del equipamiento necesario (unidades de carga, scanner); en estos casos, es mejor recurrir a las placas de HPTLC, porque son más efectivas.

2.3 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Fue la forma original de cromatografía líquida realizada por primera vez en 1906 por Tswett. La fase estacionaria normalmente se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de diámetro. Se utilizan muchas clases de materiales de empaque que van desde la alúmina, gel de sílice, tierra de diatomeas, hasta resinas sintéticas y derivados polisacáridos. Se usan todos los tipos de cromatografía líquida. Lo habitual es que la fase móvil se deje percolar a través de la columna por gravedad. No se usa mucho en el análisis de alimentos ya que es una técnica para la separación cromatográfica de mezclas de sustancias. Sin embargo, hoy en día existe un sistema cromatográfico completo y 11

automático diseñado para el análisis bioquímico que se conoce como “cromatografía líquida rápida para proteínas”. Estos instrumentos emplean un rango de fases en columnas de plástico de 5 o 10 cm que operan bajo presión moderada. Se revolucionó el uso de la cromatografía en columna para la purificación de soluciones de prueba o para extraer las sustancias deseadas de las soluciones, debido a la introducción de cartuchos cortos de plástico y desechables de minicolumnas, preempacados con una variedad de fases de separación con partículas de tamaño relativamente grandes, por ejemplo, cartuchos de Bond-Elut y Sep-Pak. Las soluciones de prueba, de lavado o extracción pasan rápidamente a través de los cartuchos con un poco de vacío generado a través de una bomba de agua. La mayoría de los métodos de purificación tales como la extracción líquido-líquido, la TLC y la cromatografía en columna de vidrio que se usan antes de la espectofotometría, la GLC, la HPLC etc…, pueden ahora realizarse en forma más eficiente usando estos cartuchos.

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3. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC

3.1 FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
En la cromatografía líquida los componentes de una mezcla son llevados través de una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su interacción con las fases.

Se lleva a cabo una cromatografía líquida en fase normal cuando la fase estacionaria es relativamente polar y la fase móvil es relativamente apolar. Se realiza una cromatografía en fase inversa cuando la fase estacionaria es relativamente apolar y la fase móvil es relativamente polar. Hay cuatro tipos básicos de cromatografía en los que la fase móvil es un líquido: -Cromatografía de reparto, para especies poco polares pero no iónicas de masa molecular < 104 g/mol. -Cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido, para especies no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular < 104 g/mol. -Cromatografía de intercambio iónico, para especies iónicas de masa molecular < 104 g/mol. -Cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía en geles, para solutos con masa molecular >104 g/mol. La elución de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase móvil a través de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porción de muestra se introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se distribuyen por sí mismos entre las dos fases según la naturaleza química de éstos con respecto a las fases móvil y estacionaria. Adicciones posteriores del disolvente llevan a las moléculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que salen de ella en una tiempo determinado (tx) 13

Columna cromatográfica:

La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fracción de tiempo que ha necesitado para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta velocidad será pequeña para solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria, y será grande para solutos que tengan mayor afinidad por la fase móvil. El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la señal se transforma en una gráfica en función del tiempo, un cromatograma, que consta de una serie de picos simétricos. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa (posición en el eje) como cuantitativamente (área bajo los picos) los componentes de la muestra. La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación de la altura o del área del pico de un analito con el de uno o más estándares. Ambos parámetros varían linealmente con la concentración. La cromatografía cualitativa se basa en la comparación de la posición de los picos (tiempos determinados de retención) con cromatogramas estándares. Ejemplo de cromatograma con un detector de Absorbancia:

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La efectividad de la columna cromatográfica para la separación de solutos depende de las velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. La eficiencia máxima para la cromatografía líquida ocurre a muy bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamaño de la partícula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase móvil o se incrementa la temperatura. En una primera etapa, la cromatografía de líquidos se llevaba a cabo en columnas de vidrio con diámetros de 1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas partículas de la fase estacionaria no superaban las150-200 µm de diámetro a fin de asegurar unos caudales razonables. Incluso así, los tiempos de separación eran largos, podían llevar varias horas. La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid Chromatografy) es el método más sofisticado y moderno de la cromatografía líquida, que utiliza partículas de fase estacionaria para el interior de la columna con diámetros muy pequeños para aumentar la eficiencia, entorno a 3-10 µm. Así, se ha conseguido reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de diámetro en la HPLC, y el tiempo necesario para la separación, de minutos a 1h. Fotografía de los intrumentos básicos de laboratorio para la HPLC:

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3.2 INSTRUMENTACIÓN
Para la cromatografía líquida se necesitan varios aparatos. Este es un esquema del conjunto de aparatos necesarios:

Las columnas de HPLC estas hechas de acero inoxidable, con un diámetro interno de 2-5 mm y una longitud variable de 10 a 30 cm, dependiendo del diámetro de las micropartículas que contiene la columna (fase estacionaria), que puede ser de 310µm. Como cierre de las columnas se utilizan placas filtrantes de acero que no dejen escapar las micropartículas de la columna. En muchos casos se utiliza una precolumna para eliminar contaminantes y partículas de polvo. Distintos tamaños de columnas:

La mayor parte de los instrumentos comerciales modernos están equipados con calentadores de columna, que controlan la temperatura desde la cercana al ambiente hasta 150 ºC. Manteniendo la temperatura constante se obtienen mejores cromatogramas. Existe una gran variedad de materiales de relleno de las columnas según las distintas separaciones. Básicamente, las micropartículas utilizadas están compuestas de sílice, aluminio o resina. Pueden ser de dos tipos: 16

-Partículas enteramente porosas, de forma irregular y diámetro 3-10µm. -Partículas esféricas de superficie porosa, con diámetros de 30-60µm y un núcleo imposible de atravesar. Son necesarias bombas de presión de varios centenares de atmósferas para conseguir velocidades de flujo razonables con micropartículas de 3-10µm debido a la resistencia que ofrecen. Como consecuencia, el equipo de HPLC es más costoso y elaborado que el de otros tipos de cromatografía. Las elevadas presiones que generan las bombas no constituyen un peligro de explosión, puesto que los líquidos no son muy compresibles. Se dispone de varios reservorios de disolvente que pueden contener cada uno más de 500 ml. Es necesario que estos reservorios vayan acompañados de desgasificadores para eliminar los gases del disolvente, pues producen burbujas en la columna interfiriendo en los resultados. Para una buena elección de la fase móvil o disolvente, hay que tener en cuenta que la interacción con la fase estacionaria (micropartículas) debe ser óptima y la separación debe ser lo más rápida posible. Los parámetros que determinan el tipo de disolvente a utilizar son: viscosidad, transparencia al UV, punto de ebullición, índice de refracción, inercia frente a la muestra, resistencia a la corrosión, toxicidad, precio y mantenimiento. El sistema de inyección de muestra que más se emplea se basa en "asas de muestreo", que son bucles o válvulas dosificadoras que permiten una aplicación cuantitativa y reproducible a presión elevada. Proporcionan una selección del tamaño de la muestra que va desde 5 a 500µl. La muestra se pasa primero al bucle sin presión, para luego pasar a la columna accionando el flujo del disolvente con una llave de varias vías o válvulas de membrana. La muestra no debe contener sólidos para que no se atasque la columna, si es necesario deberá filtrarse por un filtro de membrana o precolumna. Lo mejor es disolver la muestra en el eluyente que se vaya a emplear en la separación. El volumen inyectado de muestra debe ser lo más pequeño posible, para que los resultados aparezcan más nítidos. Para HPLC se emplean distintos detectores dependiendo de la naturaleza de la muestra. -Detectores selectivos: responden a una propiedad del soluto en disolución. Son los detectores ultravioleta/visible (UV/Vis), detector de fluorescencia y detector electroquímico. El más utilizado es el UV/Vis, sobre todo el espectrofotómetro, que registra sustancias que absorben la radiación ultravioleta o visible. Los hay muy sensibles, son relativamente independientes de las oscilaciones de temperatura y se pueden utilizar en la elución en gradiente. -Detectores universales: responden cuando una propiedad de la fase móvil es cambiada por la presencia de un soluto. Son el detector del índice de refracción (RI) y el detector de conductividad.

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El más utilizado es el detector RI, que registran todas aquellas sustancias que presenten un RI distinto al de la fase móvil pura. La señal será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia en el RI. Es necesario un control estricto de la temperatura y no se pueden utilizar para separaciones por elución en gradiente.

3.3 APLICACIONES AL ANÁLISIS DE LOS ALIMENTOS
La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condición, es imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la fase móvil un líquido. Es la técnica analítica de separacón más ampliamente utilizada debido a sus cualidades de sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y su gran adaptabilidad a sustancias que son de gran interés para la industria, la ciencia y la sociedad. El empleo de HPLC en sus muchas variantes se ha especializado mucho. Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenos, plagucidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una gran variedad de sustancias inorgánicas. Ejemplos de utilización de HPLC: -Detección y cuantificación de sacarina, benzoatos, cafeína y aspartame en refrescos. -Detección de ciclomato en jugos de fruta. -Separación de ésteres de ácidos grasos por fase inversa y con argentización de columnas (Silicato de Al con Ag). -Separación de Triglicéridos por la longitud de la cadena y el grado de insaturación por fase inversa y detector de dispersión luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas. -Determinación del contenido de Vit A y sus precursores (α y β caroteno) en margarina y aceites de hígado por fase inversa. -Determinación del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase normal.

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4. CROMATOGRAFÍA DE GASES. GC

4.1 FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BÁSICOS
La cromatografía en fase gaseosa es un procedimiento para la separación de compuestos volátiles, que fluyen en una corriente gaseosa a través de una fase estacionaria fijada a un tubo largo y fino. El gas portador (inerte, por ej., nitrógeno, helio, hidrógeno y argón) transporta una muestra representativa de la sustancia inyectada. En una separación se parte de la base, de que cada componente será disuelto o adsorbido por la fase estacionaria. Los distintos componentes serán retenidos por esta fase con mayor o menor fuerza y alcanzarán correspondientemente el final de la columna, donde se encuentra el detector, después de un tiempo de flujo de gas portador más o menos largo. La cromatografía de gases permite obtener resultados tanto cualitativos como cuantitativos. Se utilizan fundamentalmente estas alternativas de separación: 1. A mayor disolución, la separación de compuestos con estructura química similar se consigue utilizando tiempos relativamente largos. 2. A menor disolución se realiza la separación rápida de mezclas de compuestos sencillos conocidos.

4.2 INSTRUMENTACIÓN
Actualmente más de 30 fabricantes de instrumentos ofrecen unos 130 modelos distintos de equipos para cromatografía de gases. En las últimas décadas, los instrumentos que han aparecido en el mercado presentan muchos cambios y mejoras. En los años setenta, se hicieron habituales los integradores electrónicos y los equipos de procesado de datos basados en un ordenador. Los años ochenta introdujeron la utilización de los ordenadores para el control automático de la mayoría de los parámetros instrumentales, tales como la temperatura de la columna, caudales y la inyección de la muestra, el desarrollo de instrumentos de muy alto rendimiento a un coste moderado, y tal vez lo más importante, el desarrollo de las columnas abiertas que son capaces de separar multitud de analitos en un tiempo relativamente corto.

Componentes básicos
GAS PORTADOREl gas portador cumple básicamente dos propósitos: transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones: #

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1. Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria). 2. Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. 3. Fácilmente disponible y puro. 4. Económico y adecuado al detector a utilizar. # COLUMNAS DE SEPARACIÓN Y FASES ESTACIONARIAS

Si la fase estacionaria es una sustancia sólida, esta modalidad de la GC se denomina gas-solid-chromatography. Si la fase estacionaria es un líquido no volátil (viscoso) aplicado formando una película dentro de una fina columna, se denomina gas-liquid-chromatography. Dado el elevado número de fases líquidas que existen para temperaturas superiores a 400ºC, la GLC es la más versátil y seleccionada de las GC. Permite la investigación de compuestos gaseosos (es decir, de peso molecular relativamente bajo). La cromatografía de gas-líquido se abrevia normalmente como cromatografía de gases debido a su gran aplicación en todos los campos de la ciencia. La GC se divide en: a) GC con columnas empaquetadas y b) GC con columnas capilares. a) El primer caso se trata de columnas convencionales con un diámetro interno(ID) superior a 1mm y longitudes de 2-3m (de vidrio, metal), rellenas de granulados sólidos en los que están embebidas las distintas fases. b) Las columnas capilares son capilares largos de vidrio o sílice (ID:0.2-0.3mm, longitud: como norma 50m), existen diferentes tipos de capilares. Debido a la alta resolución que se consigue al trabajar con columnas capilares, la GC capilar se suele denominar también cromatografía gaseosa de alta resolución (HRGC). # SISTEMA DE INYECCIÓN MUESTRA-

La muestra debe introducirse rápidamente en la columna. Normalmente, los líquidos se introducen en la columna por medio de jeringuillas de inyección (jeringuillas de microlitro con un volumen total de 0.5 a 10µl) a través de una membrana de goma (septo) del inyector termostatizado y los componentes se vaporizan; la cantidad inyectada se lee directamente en la escala de la jeringuilla graduada. La cantidad de la muestra a utilizar depende del tipo de columna, de la cantidad de fase estacionaria contenida en la columna o del espesor de la película en el caso de los capilares de película fina, de la solubilidad de los componentes importantes en la fase estacionaria (es decir, de la polaridad de soluto y disolvente) y de la temperatura. Controlando los cambios de temperatura de la columna (horno) durante el análisis se puede, alcanzar el intervalo de temperatura óptimo para cada componente o fracción individual, de manera que para cada componente de la mezcla se obtengan picos claros, en el caso ideal completamente separados.

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DETECTORES

El detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y la magnitud de la propiedad física. En cromatografía un detector funciona comparando una propiedad física entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta acción se traduce en una señal tipo eléctrica, que posteriormente se amplificará mediante un registrador gráfico o integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes. Un detector muy utilizado en la analítica general de los alimentos es el detector de ionización de llama (FID). En él se mide, registra y amplifica el flujo iónico resultante de la ionización de las moléculas en una llama de hidrógeno (gases de combustión necesarios: hidrógeno y aire comprimido). El FID es un detector de los denominados universales o inespecíficos, especialmente adecuados para medidas cuantitativas. Es un detector dependiente del flujo de masa, es decir, la señal es tanto mayor, cuánta más sustancia se ioniza en la llama en la unidad de tiempo. En el análisis de las cantidades traza se utilizan por lo general detectores que presentan una elevada sensibilidad para determinadas sustancias, son los denominados detectores específicos. Tiene especial importancia en el análisis de residuos y de contaminantes, el detector de captura electrónica (ECD). El ECD posee la característica de detectar aquellas sustancias que poseen una elevada afinidad electrónica (por ej., los halógenos, aunque también otros grupos funcionales de la mólecula con afinidad por los electrones). Al contrario que el FID, el ECD mide una reducción de la señal en lugar de una amplificación.

4.3 APLICACIONES AL ANÁLISIS DE ALIMENTOS
♦ Separación e identificación de azúcares de forma cualitativa y cuantitativa después de una conversión a derivados volátiles termoestables. ♦ Determinación rápida y precisa de la composicón los Ácidos grasos en los aceites y las grasas tras efectuar la conversión de los ésteres de triglicéridos en ésteres metílicos, que son más volátiles. Así se conoce con más detalle la composición isomérica, geométrica y posicional de los triglicéridos en la Ácidos grasos. ♦ Identificación y determinación de ésteres metílicos de Ácidos grasos poliinsaturados individuales. ♦ Determinación del contenido de isómeros trans en aceites, grasas y alimentos grasos. ♦ Separación entre α y β tocoferol (UPLE). ♦ Separación y determinación de alcoholes de azúcar de sus derivados del trimetilsilil éter (TMS). ♦ Determinación del sorbitol, el manitol y el xilitol en las frutas en capilares de vidrio.

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BIBLIOGRAFÍA
LIBROS
Principios de Análisis Instrumental. 5ª ed (2001). Douglas A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman. Mc Graw-Hill Interamericana. Análisis Instrumental. (2001). K.A. Rubinson, J.F. Rubinson. Prentice Hall. Análisis de los Alimentos. (1992). Matissek, Schnepel, Steiner. Ed. Acribia, S.A. Composición y Análisis de los Alimentos de Pearson. 2ª ed (1996). R.S. Kirk, R. Sawyer, H. Egan. Química Analítica. 6ª ed. (1997). Skoog, West, Holler. Mc Graw-Hill.

PÁGINAS WEB
www.dq.fct.unl.pt/qof/hplcts.html www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografía/hplc.html www.merck.com.pe/MPSA%5csite%5cwmsp.nsg/contents/cromatografía www.hplc.co.uk/homeframe.htm www.shu.ac.uk/virtual_campus/courses/241/hplc.htm www.dicdoc.ucv.cl/lab_sibyl www.lafaw.com www.aldbot.com/HPLC-Analysis.htm www.richardscientific.com http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/ http://biología.med.ub.es:8080/curso/curso.html http://latina.chem.cinvestad.mx/RLQ/tutoriales/cromatografía/Gas.htm

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