Introducción a las Separaciones Cromatográficas

Definiciones y Términos comúnmente empleados en los métodos cromatográficos

Preparo: Prof. Jorge Castillo

1. Tiempo de retención (tR) - Tiempo (en segundos usualmente) que la muestra pasa en la columna. Es
medido a partir del punto de inyección a el momento en que aparece la altura máxima del pico. Es
característico para cada analito en la determinada fase móvil/fase estacionaria.

2. Tiempo muerto (tM o to) - También conocido por tiempo cero ó tiempo de retención del disolvente.
Representa el tiempo requerido para que eluya un compuesto no retenido por la columna. Puede ser
empleado para medir el volumen o espacio dentro de una columna.

3. Tiempo de retención relativo (t’R) - También conocido como tiempo de retención ajustado.
Representa el tiempo que el soluto pasa “absorbido” dentro del empaque de la columna. Se calcula
restando al tiempo de retención (tR) el tiempo muerto (tM).
t’R = tR - tM

4. Ancho de base (Wb) - Es la porción de la linea base intersectada por tangentes dibujadas en el pico.
Es igual a 4σ de un pico tipo Gauss y es necesaria para calcular los platos teóricos y la resolución.
(W1/2) es el ancho del pico a la mitad de la altura del pico, generalmente es más usada que Wb para
calcular el numero de platos teóricos por ser más representativa del pico.

5. Velocidad lineal de la fase móvil (µ o u) - Se emplea en la elaboración de gráficas para efectuar

estudios de eficiencia en columnas. Se gráfica generalmente H vs µ para obtener gráficas conocidas
como: gráficas de van Deemter.

µ = Lc / tM = Largo de la columna (cm) / Tiempo muerto (sec)

6. Número de platos teóricos (N) - Es la longitud de columna requerida para que se establezca un
equilibrio del soluto entre las fases móvil y estacionaria. El número de platos teóricos mide que tan
buena es una columna, la cual debe tener un número grande de platos teóricos y producir picos
angostos. Algunas formas empleadas para incrementar los platos teóricos incluye: Alargar la
columna, disminuir el diámetro de la columna, mejorar el empaque, disminuir la cantidad de muestra
y optimizar el flujo de fase móvil. La definición de plato teórico (y altura de plato) a permanecido
desde la teoría propuesta por Martin y Syle, postulada para tratar de explicar eficiencias en las
separaciones cromatográficas; Según esta teoría la columna se encuentra formada por un numero N
de capas angostas y sucesivas llamadas “platos” dentro de los cuales se efectuaban equilibrios del
analito entre las fases móvil y estacionaria.
tR, Wb y W1/2 se colocan
N = 16 (tR/Wb)2 = 5.54 (tR/w1/2)2 en las mismas unidades
(tiempo o distancia)

7. Altura de un plato teórico (HETP ó H) - Representa el largo de columna requerida por un plato
teórico. Según Syle y Martin: representa la longitud de las capas continuas (platos) que componen
una columna. H es empleada como medida de la eficiencia de una columna. Cuando el valor es
pequeño representa una eficiencia mayor. H es empleada además como parámetro para determinar
el ensanchamiento de una banda.

H = Lc / N

8. Coeficiente de partición (K) - Es el valor de la constante de equilibrio formado por el analito entre las
fases móvil y estacionaria. Es constante para una temperatura y característica para cada relación de
analito-fase móvil-fase estacionaria.

K = CS / CM = Conc. Analito en la fase estacionaria [gr/ml]/Conc. Analito en la fase móvil [gr/ml]

K = k’ x β β = VM / VS = Volumen fase móvil / Volumen fase estacionaria
9. Factor de retención (k’) - También conocida como relación de capacidad, representa la relación de
tiempo que el soluto pasa en la fase estacionaria con respecto al que pasa en la fase móvil.

k’ = [(KVS)/ (VM )] = t’R / tM

10. Volumen de fase móvil (VM) - Volumen de fase móvil contenida en la columna

VM = (tM )( F ) F = Flujo de fase móvil

11. Factor de separación (α) - Conocida además como Selectividad ó factor de retardación. Determina
las separaciones entre picos, un valor de α = 1 representa tiempos de retención iguales y por lo tanto
no existe separación. Un número más grande significa una columna más selectiva y una mejor
resolución . Los valores grandes de α son el resultado de una fase estacionaria selectiva.

1 = Primer compuesto en salir, (eluir)

α =K2/K1 = t’R(2) / t’R(1) = k’(2) / k’(1)
2 = Segundo compuesto en eluir

12. Resolución (RS) - Es una medida cuantitativa del grado de separación de dos picos. Un valor de 1.5
representa una separación hasta la linea base de ambos picos, y un valor de 1.0 , representa una
resolución del 90%, en algunos casos esto es suficiente para los cálculos del área de los picos
(análisis cuantitativo).
2 ∆t R
RS = ∆tR es el intervalo entre los picos, W1 y W2 son
W 1 +W 2 los anchos de los picos 1 y 2. Ambas medidas
en las mismas unidades ( tiempo o centímetros)

13. Ecuación de resolución maestra - Esta ecuación es derivada de las definiciones de N, RS y α.

Muestra que la resolución es el producto de tres factores independientes.

 N   α   k' 
RS =   •  • 
 4   α − 1  1 + k ' 

Otra fórmula importante en la cual se deriva de definiciones anteriores es:

16( R S ) H   α   (1 + k ' B ) 
 2  3

(t )
R B = •
  • 
µ   α − 1   ( k ' B )
 2
 
14. Ecuación de van Deemter - Esta ecuación es empleada para aproximar la eficiencia de las columnas
cromatográficas y comprende tres factores:

H = A + B / u + Cu
H = A + B / u + (C S + C M )u

Termino multicaminos (A) - Es ocasionado por la multitud de caminos de diferente longitud,

creados dentro del empaque de la columna, así dependiendo del camino tomado por las
partículas, estas llegaran al final de la columna a diferentes tiempos por lo que se ensanchan
los picos cromatográficos. A este fenómeno se le llama también “Difusión de Eddy”.Además en
este factor se encuentra el efecto ensanchante provocado por la presencia de “lagunas” de
 fase móvil dentro del empaque. Aumenta este factor al aumentar el flujo de fase móvil.

Factor de Difusión longitudinal (B/u ) - Depende del coeficiente de difusión del analito en la
fase móvil, lo cual resulta en ensanchamiento de los picos cromatográficos. Resulta muy
importante a bajos flujos de fase móvil, pero conforme se aumenta el flujo se hace cada ves
mas pequeño, debido a que la muestra reside en la columna menos tiempo y por tanto el
efecto de la difusión es menor. Como la difusión es mayor para un gas que para un líquido,
este termino es importante en GC.

Factor de transferencia de masa entre las fases (Cu) - La fase estacionaria es, generalmente
una película que recubre a un soporte, cuando las moléculas de soluto entran en la columna,
algunas de ellas serán dejadas atrás dependiendo de la interacción que tengan con la fase
estacionaria, tal interacción dependerá de: el coeficiente de difusión del soluto en la fase móvil,
el ancho de la película y del factor de capacidad, cuando se trate de fases estacionarias
líquidas; y solo del factor de capacidad (que tan fuerte es absorbido o desabsorbido el soluto) y
del diámetro de la partícula, en el caso de soportes sólidos.

15. Recuerde que existen solo dos formas para mejorar las separaciones cromatográficas:

a).Incrementar la separación de las bandas - Aunque se mejora la separación de los

componentes este método tiene el inconveniente de que ocasiona ensanchamiento de
las bandas y se requieren tiempos de elución mayores. Ej. al emplear flujos de fase
móvil menores, Al aumentar el largo de la columna, Al variar la fase estacionaria
(modificando k’), finalmente, incrementando α ya sea variando la temperatura (GC), o la
composición de la fase móvil (HPLC)

b).Disminuir el ensanchamiento de los picos - Resulta la forma ideal de trabajar pero por
desgracia las variables que afectan el ensanchamiento de las bandas solo pueden ser
disminuidas hasta cierto grado debido a restricciones técnicas. Ej. Incrementando la
eficiencia de la columna ya sea, disminuyendo el diámetro de la columna (ej. col.
capilares en GC), o empleando empaques más pequeños (diámetro de partícula,
GC/HPLC).

16. Los factores que pueden afectar las separaciones cromatográficas son:

Independientes del Operador Dependientes del Operador

a). Diámetro de columna g). Composición de la fase móvil

b). Longitud de columna
c). Composición de fase estacionaria
d). Diámetro de las partículas de relleno
e). Diámetro de la película de fase móvil
f). Uniformidad del empaquetamiento
h). Flujo de fase móvil
i). Temperatura
j). Volumen de Injección
k). Modificación química de la fase estacionaria