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Introducción a las separaciones

cromatográficas

Federico Williams
fwilliams@qi.fcen.uba.ar
2do. cuatrimestre 2007
Invención de la cromatografía: Mikhail Tswett (1906)

“If a petroleum ether solution of chlorophyll filters through a column of an adsorption material (I use chiefly
calcium carbonate which is firmly pressed into a narrow glass tube), the pigments will separate according to
the adsorption series from above downward in differently colored zones, and the more strongly adsorbed
pigments will displace the more weakly held ones which will move downward. This separation will be
practically complete if, after one passage of the pigment solution it is followed, by a stream of pure solvent
through the adsorbing column. Like the light rays of the spectrum, the different components of a pigment
mixture in the calcium carbonate column will be separated regularly from each other, and can be
determined qualitatively and also quantitatively. I call such a preparation a chromatogram and the
corresponding method the chromatographic method.”
Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft 24, 316-23 (1906) [traducido en: Henry M. Leicester,
Source Book in chemistry 1900-1950 (Cambridge, MA: Harvard, 1968)]
Descripción general de la cromatografía

Cromatografía es un método de separación que permite separar componentes de mezclas


complejas. La muestra se desplaza con una fase móvil (gas, líquido, fluido supercrítico) que
se hace pasar sobre una fase estacionaria con la que es inmiscible y que se fija a una
columna o superficie sólida.

Las dos fases se elijen de tal modo que los componentes se distribuyen de modo distinto
entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente
retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil. Por el
contrario, los componentes que se unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con
rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se
separan en bandas que pueden analizarse cualitativa y cuantitativamente.
Clasificación de la Cromatografía
Cromatografía en Plano Cromatografía en Columna

La fase estacionaria se fija sobre una Un tubo estrecho contiene la


placa plana y la fase móvil se desplaza fase estacionaria a través de la
a través de la fase estacionaria por cual se hace pasar la fase
capilaridad. móvil por presión.
Tipos de cromatografía en columna
Otra clasificación se basa en el tipo de fase móvil, tres clases generales de
cromatografía donde la fase móvil son líquidos, gases o fluidos supercríticos.
Elución en columna
Dilución del analito: el tamaño de la banda original
que contiene los analitos es más pequeña que las
zonas que llegan al detector. Por lo tanto los detectores
deben ser más sensibles que los que serían necesarios
si no fuera imprescindible la separación.

A medida que aumenta la migración, aumenta la


distancia entre las bandas, pero estas se
ensanchan, disminuyendo la eficacia de la columna.

Cromatograma: La posición de los picos en el


eje del tiempo puede servir para identificar los
componentes de la muestra y el área bajo la
curva proporcionan una medida cuantitativa de
la cantidad de cada componente.
Las formas de los picos cromatográficos
La teoría cinética de la cromatografía explica las formas de los picos y los efectos de
distintas variables sobre el ancho de los mismos.

Las bandas cromatográficas ideales tienen forma gaussiana y se puede atribuir a la


combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las numerosas moléculas de soluto en
la banda cromatográfica.

Una molécula de soluto experimenta miles de transferencias entre la fase estacionaria y la


fase móvil durante la migración. El tiempo que pasa en cada una es muy irregular y depende
que gane accidentalmente suficiente energía térmica del medio para que se produzca la
transferencia. Dado que la molécula se eluye solamente cuando reside en la fase móvil, su
migración a través de la columna es muy irregular. Ciertas moléculas se desplazan con
rapidez, otras se retrasan debido a que han sido retenidas mayor tiempo que el promedio en
la fase estacionaria. La consecuencia de estos procesos individuales aleatorios es una
dispersión simétrica de las velocidades alrededor del valor medio.

El ancho de la banda aumenta a medida que se mueve a través de la columna, debido a que
se dispone de más tiempo para que la dispersión tenga lugar. El ancho de la banda está
relacionado directamente con el tiempo de residencia en la columna e inversamente
con la velocidad con la que fluye la fase móvil.
Efectos de las velocidades de migración y del
ensanchamiento de banda sobre la resolución

El primer componente avanza en la


columna a mayor velocidad

Disminución del ensanchamiento


de bandas

Optimizar la separación implica: (i) modificar la velocidad relativa de


migración de los componentes y (ii) reducir el ensanchamiento de banda.
Qué factores determinan (i) y (ii)?
Velocidades de migración de los solutos
Velocidad lineal promedio de migración

L
Fase móvil u=
tM

L
Soluto v=
tR
constante de distribución: cromatografía lineal
cS
Amóvil ←
→ Aestacionaria K= Tener en cuenta que NO hay un equilibrio ya que
cM no se puede alcanzar con la fase móvil moviéndose
continuamente
L cM VM 1 1
v = = u× = u× = u×
tR cM VM + cSVS 1 + KVS / VM 1 + k ´A
Factor de retención Factor de selectividad (definido mayor que 1)

K AVS t R − tM K B k B´ (t R ) B − t M
kA =
´
= α= = ´ =
VM tM K A k A (t R ) A − t M
Efecto de la isoterma
Se asume que la constante de distribución es constante y por lo tanto un gráfico de C(S)
vs C(M) es lineal.

Isotermas no lineales (C(S) vs C(M) a T cte) se observan en ciertos casos y resultan en


picos asimétricos y tiempos de retención que dependen en la concentración del analito
en la fase móbil y por lo tanto en el tamaño de las muestras inyectadas.

C(S)

C(M)
Eficacia de la columna
L La eficacia de la columna aumenta cuanto mayor es el número de platos
N= (N) y cuanto menor es la altura del plato (H). (L es la longitud del relleno de
H la columna). Tanto N como H se toman como medidas de la eficacia de la
columna.

El ancho de la curva gaussiana está


relacionado con la varianza o la desviación
estándar. Y definimos la eficacia en los
términos de la varianza por unidad de longitud.

Por lo tanto, H y N se pueden determinar a


partir de un cromatograma:

LW 2 tR 2
H= 2
N = 16( )
16t R W

Modelo de platos de Martin y Synge no representa la realidad (aunque predice forma


Gaussiana no justifica el ensanchamiento del pico): modelo de la velocidad
Teoría de van Deemter
Tomamos a H como una medida inversa de la eficacia de la columna

B
H = A + + Cu
u
A = 2λd p Caminos múltiples
de flujo

B 2γDM
= Difusión longitudinal

u u
Transferencia de
masa entre las fases

Cu = (CS + CM )u =
f S (k ´ )d 2f f M (k ´ )d p2
=( + )u
DS DM
Coeficientes A, B y C

Término del camino múltiple (A): El ensanchamiento de banda


surge en parte debido a la multitud de caminos por los cuales las
moléculas pueden caminar a través de la columna rellena. La
longitud de estos caminos puede diferir significativamente y por lo
tanto el pico se ensancha.
Término de la difusión longitudinal (B/u): Los solutos difunden
desde la zona central donde es mayor la concentración hacia las
regiones más diluidas situadas por delante y por detrás de la banda,
es decir en el mismo sentido y en el sentido opuesto del flujo de la
fase móvil. Cuanto mayor es el flujo, menos sucede la difusión del
centro de la banda a los costados y menor es el ensanchamiento.
Término de transferencia de masa (C u): Las columnas
cromatográficas siempre trabajan en condiciones alejadas del
equilibrio entre la fase móvil y la fase estacionaria. Se requiere un
tiempo para que el analito difunda desde una fase hacia la interfase
para que se produzca la transferencia y esto ensancha el pico. El
ensanchamiento por transferencia de masa se debe a la difusión que
tiende a ocurrir perpendicularmente a la dirección de flujo y por lo
tanto cuanto mayor es la velocidad de flujo, menos tiempo hay para
que se produzca la transferencia y menor es el ancho del pico.
Efecto del tamaño de partícula en la eficacia de la
columna

El diámetro de las partículas que constituyen el relleno de la


columna afectan la eficacia de la columna.
Resolución

2(t R , B − t R , A )
R= =
wB + wA
N ⎛ α − 1 ⎞ ⎛ k B' ⎞
⎜ ⎟⎜ ⎟
4 ⎝ α ⎠ ⎝ 1 + k B' ⎠

Para una fase estacionaria


determinada, la resolución
puede aumentarse
alargando la columna (y así
aumentando el número de
platos). La consecuencia
negativa es el incremento del
tiempo requerido para la
separación.
Eficiencia de la separación
N = L/H → columna, efectos cinéticos, ensanchamiento de banda

N α A, B − 1 ⎛ k B ⎞
⎛ ⎞ '
R= ⎜⎜ ⎟⎟ ⎜ ' ⎟
4 ⎝ α A, B ⎠ ⎝ 1 + k B ⎠

Partición f.móvil/f.estacionaria, efectos termodinámicos


L NH (1 + k B´ ) 16 RS2 H α 2 (1 + k B´ )3
t R,B = = = ( )
vB u u α − 1 k ´2
b

Si bien se busca la mejor resolución en el menor tiempo posible,


pero las dos propiedades no se pueden llevar a su máximo para
las mismas condiciones
Influencia del factor de retención

k’ óptimo entre 2 y 5 aproximadamente


Variables que afectan la eficacia de la columna

Al buscar las condiciones óptimas debe tenerse en cuenta que los


parámetros fundamentales α, k´y N (o H) pueden ajustar más o
menos independientemente.

La manera más fácil de modificar α y k´es variando la temperatura


o la composición de la fase móvil o el relleno de la columna. Es
posible cambiar N modificando la longitud de la columna y H por
alteración del caudal de fase móvil, el tamaño de la partícula de
relleno y la viscosidad de la fase móvil.

Se puede aumentar la resolución aumentando el número de platos


teóricos de la columna, pero esto es costoso en términos del
tiempo necesario para completar la separación, a no ser que el
aumento de N se lleve a cabo mediante una reducción de H.
Efecto del solvente
Ejemplo: variación del factor de selectividad variando el solvente
El problema de la elución

Solución: cambiar las condiciones que determinan k´mientras tiene


lugar la separación (por etapas o de forma continua), por ejemplo:
variar la composición de la fase móvil (CL) o variar T (CG).
Efecto de la temperatura

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