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Cromatografía

Cromatografía

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Cromatografía de Gases (CG)
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)
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República Bolivariana de Venezuela Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanálisis Cátedra: Análisis Instrumental

Técnicas Cromatográficas

Maracaibo, 24 de Julio de 2008

Cromatografía de Gases: 1. Estudie las definiciones y términos siguientes  Cromatografía  Cromatograma  Elusión  Fase Móvil  Tiempo de Retención  Ancho de base  Fase Estacionaria  Altura del plato teórico.  Eluyente  Resolución  Tiempo muerto  Números de platos teóricos 2. Establezca diferencias entre los métodos de Cromatografía de Gases  Cromatografía de Gases  Cromatografía de Líquidos 3. Identifique los componentes generales de un Cromatógrafo de Gas y estudie la función de cada una de ellas. 4. Clasifique los diferentes detectores utilizados en Cromatografía de Gases. 5. Enumere las características de la Fase Estacionaria y Fase Móvil en Cromatografía de Gases 6. Como es normalmente un Cromatógrama en Gases. 7. Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la Cromatografía de Gases Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) 1. Describa el fundamento de HPLC 2. Establezca la clasificación de los tipos de HPLC 3. Elabore un esquema con los componentes esenciales de un Cromatógrafo líquido, y estudie la función de cada uno de ellos.  Enumere las características de la Fase Estacionaria  Enumere las características de la Fase Móvil  Establezca las características del soporte ideal en la fase est5acionria de HPLC. 4. Enumere los tipos de Detectores usados en HPLC 5. Establezca diferencia entre separación isocrática y separación con gradiente 6. Como afecta los siguientes parámetros en la Resolución de la columna: 7. Enumere las aplicaciones de la HPLC

1.-Estudie las definiciones y términos siguientes: 1.1.- Cromatografía: Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es que no se conoce su composición. La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser sólida o líquida. 1.2.- Cromatograma: Es una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. Registro producido por el cromatógrafo de gas / líquido. Es también una medida del funcionamiento del instrumento. 1.3.- Elución: Es el procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequeña cantidad en un tiempo breve. 1.4.- Fase Móvil: Puede ser un líquido o un gas que recorre la columna cromatográfica transportando los componentes de la mezcla a través de dicho sistema. 1.5.- Tiempo de Retención: Es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima intensidad. Los tiempos de retención no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna cromatográfica. 1.6.- Ancho de Base: Es la separación de la longitud de las bases interceptado por agentes delongados en el detector. 1.7.- Fase Estacionaria: Es la que recubre la columna cromatográfica, interiormente sin desplazarse. La fase estacionaria consiste en partículas, generalmente sólidas, pequeñas y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa. 1.8.- Altura del Plato Teórico: Se utiliza como una medida de la eficiencia de la columna, este directamente relacionado con la

varianza, por ello resulta convenientemente medir la eficiencia de la columna en los términos de varianza y longitud de la columna. 1.9.- Eluyente: Es aquella sustancia que se pone en contacto con la fase estacionaria y permite que se desplace la muestra. 1.10.- Resolución: Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes. Se define como:

Donde Rs es la resolución, tRA y tRB son los tiempos de retención de los componentes A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores componentes. 1.11.- Tiempo Muerto: Es el tiempo de retención del componente inerte o gas portador. 1.12.- Número de Platos Teóricos: Se utiliza como una medida eficiente de la columna. 2.- Establezca las diferencias Cromatografía de Gases. entre los métodos de

En cromotografía de gases se incluyen todos los métodos cromatográficos en los que la fase móvil es un gas (gas portador), siendo la fase estacionaria un líquido (CGL) o un sólido (CGS).

La cromatografía gas-sólido (CGS): Tiene una fase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los analitos debido a la adsorción física sobre la superficie del sólido. Esta técnica ha tenido una aplicación limitada debido a la tendencia de los picos de elución a formar colas y a la retención semipermanente de gases activos sobre la fase estacionaria. La cromatografia gas-líquido (CGL): Se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte (soporte) o en las paredes interiores de la columna, si ésta es capilar.

3.Identifique los componentes generales de un Cromatógrafo de Gas, y estudie la función de cada una de ellas:

Gas Portador: es un gas inerte, generalmente helio, nitrógeno o argón, de elevado grado de pureza. El caudal del mismo que pasa por la columna, ha de ser conocido y controlado. Cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Inyector: Es sólo una pequeña cámara colocada inmediatamente antes de la(s) columna(s) de separación, donde se accede mediante una jeringa adecuada o con una válvula de inyección. El Inyector es el lugar por donde se introduce una pequeña cantidad de muestra (del orden de 1 cm3 de gas o 1 micro-litro de líquido) en medio de la corriente de gas. También se encarga de vaporizar las muestras cuando éstas no son gaseosas. Así, la temperatura del inyector ha de ser superior a la del punto de ebullición del componente de la mezcla menos volátil. Columnas: El sistema de columnas cromatográficas constituyen el corazón de todo cromatógrafo. Cada columna se diseña para aprovechar alguna propiedad de los diferentes componentes que resulte adecuada para generar distinta velocidades de avance para cada uno de ellos durante el recorrido de la columna. Existen dos tipos: o Las columnas de relleno: Suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y teflón; con un diámetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia está en torno a 1.000-2.000 (platos teóricos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, máximo 10 componentes. o Las columnas capilares: Tienen un diámetro interior inferior a 1 mm (320-250 μm) y una longitud de 5 a 50 m. Suelen construirse con sílice fundida que le dan gran resistencia física y flexibilidad. Alcanzan una eficacia hasta de 4.000 (platos teóricos/m) y se usan para muestras complejas. La fase estacionaria se depositada sobre las paredes interiores del tubo capilar. Las columnas semicapilares tienen un diámetro interior de 530 μm que admiten cantidades de muestra similares a las columnas de relleno, y proporcionan mayor eficacia que éstas. Detector: Es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica. Podemos expresar que el detector son los "ojos" de un cromatógrafo. Es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible directamente, en una señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad física. El sistema de detección genera una señal cuando un componente de la mezcla completa el recorrido del sistema de separación. Un sistema de Integración: para cuantificar la señal generada por cada componente en el Detector.

4.- Clasifique los diferentes detectores utilizados en la cromatografía de Gases: Estos pueden ser clasificados:  Detectores según su Grado de Selectividad : o Universales: Responde a la mayoría de los solutos que pasan por él. o Específicos ó Selectivos: Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un mínimo de respuesta a otras. Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificación, obviamente, es en referencia a si la muestra es destruída o no. Detectores según su Modo de Respuesta: o Dependientes del Flujo Másico: Producen una señal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a través de él en la unidad de tiempo pero es independiente del volúmen de gas portador requerido para la elución. o Dependiente de la Concentración: Dan una señal proporcional a la cantidad de soluto por unidad de volúmen de gas portador que pasa a través de él. Detectores según el proceso de detección Ionización, Ópticoespectroscópico, Electroquímico, etc.

 

5.- Enumere las características de la Fase Estacionaria y Fase Móvil en Cromatografía de Gases:

Fase Estacionaria:    Es la forma más habitual La fase estacionaria es no polar y la móvil es polar Utiliza disolventes no polares

Fase Móvil    Es habitual Utiliza una fase estacionaria polar y una móvil no polar Utiliza disolventes polares

6.- Como es normalmente una Cromatografía de Gases. La separación de los compuestos de una mezcla se realiza en las siguientes etapas: 1.-Una vez elegida la columna y fase estacionaria, se ajustan las temperaturas de la cámara de inyección, columna y detector, así como el caudal de gas portador. Cuando la señal del detector es constante (sin ruidos la línea base) se hace la inyección de la muestra. 2.-Las muestras se inyectan en cantidades inferiores a 1 µl cuando son líquidas y sobre 1 ml si son gaseosas; se introducen en la cámara de inyección, donde se vaporizan, y son arrastradas hasta cabeza de columna. 3.-Los componentes se fijan en una pequeña zona de la columna; por equilibrios sucesivos entre fase móvil y estacionaria cada componente se desplaza por la columna a velocidades diferentes. 4.-Finalmente, los solutos que salen de la columna, pasan al detector y se obtiene el cromatograma. 7.- Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la Cromatografía de Gases: CUALITATIVAS  Identificación Cromatográfica: o Por Datos de Retención o Por Serie Homólogas (Indices de Retención de Kovacs)  Identificación No Cromatográfica: o Análisis Clásicos o Identificación por: • Adición de Estándar • Formación de Derivados • Sustracción de un Componente  Identificación con Técnicas Auxiliares: UV, IR, MS, RMN

CUANTITATIVAS  Normalización de Área  Normalización de Área con Factores de Respuesta  Estandarización Externa  Estandarización Interna

1.- Describa el fundamento de la HPLC: La cromatografía líquida es una técnica cuyo objetivo es la separación de los distintos componentes de una mezcla de sustancias, basándose en las diferentes retenciones que experimentan los componentes de la misma al pasar a través de una fase estacionaria,

cuando la muestra es eluida por una fase móvil líquida. Así, la separación de los componentes de la muestra se produce debido a sus interacciones entre una fase móvil líquida y una fase estacionaria sólida, contenida en una columna cromatográfica. Para explicar el fenómeno cromatorgráfico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y otro próximo Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o físico químicas de los analitos: solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente divididos), volatilidad, tamaño, carga, reactividad química o bioquímica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situación experimental dinámica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes: - Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si. - El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible. Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico - químicas frente a un sistema cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeñas, se basa la separación cromatográfica. 2.- Establezca la Clasificación de los tipos de HPLC:  Cromatografía de fase normal:

Fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención. La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de interés, sino también en factores estericos de forma que los isómeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de retención.

Cromatografía de fase reversa:

Consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente.Este efecto hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía libre de la entropía asociada con la minimización de la interfase compuestodisolvente polar. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. Las características del compuesto de interés juegan un papel muy importante en la retención. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. Aun así, las moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. Aparte de la hidrofobicidad de la fase móvil, otras modificaciones de la fase móvil pueden afectar la retención del compuesto; por ejemplo, la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión superficial, y como que la entropía de la interfase compuestodisolvente está controlada precisamente por la tensión superficial, la adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención. Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio por controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero también

neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografía puede variar, pero en general mejoran la separación cromatográfica. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun así, muchas columnas de fase reversa están formadas por silica modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que éstas podrían dañar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso pero no deberían estar expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes metálicas del aparato de HPLC. Cromatografía de exclusión molecular

También conocida como cromatografía por filtración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño. Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También es muy útil para la determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las proteínas purificadas. La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan en solución según su peso molecular, o más precisamente, según su radio de Stokes. En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los fines prácticos, la columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados. En consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeñas) podrán pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta. Cromatografía de intercambio iónico:

En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores iónicos son: i) Resinas de

poliestireno, ii) intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado. En general los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones elevada carga y radio pequeño. Un incremento en la concentración del contraión (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retención. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio catiònico mientras que una disminución del pH reduce el tiempo de retención en las cromatografías de intercambio aniònic.  Cromatografía basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas de formar complejos estables, específicos y reversibles. La formación de estos complejos implica la participación de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas de la muestra y la fase estacionaria. 3.- Elabore un esquema con los componentes esenciales de un Cromatógrafo líquido, y estudie la función de cada uno de ellos. Un equipo para cromatografía líquida de alta resolución puede representarse por el siguiente esquema: - Bomba: Envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño, generalmente de acero inoxidable. El sistema de bombeo debe seguir los siguientes requerimientos: 1. 2. 3. 4. 5. Generación de presiones por encima de 6000 psi(~410 atmósferas) Flujo libre de pulsaciones Intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min(con control del 0.5%) Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o Teflón) Reproducible

Tipos de Bombas: • Bombas reciprocas • Bombas de desplazamiento • Bombas neumáticas - Válvula Inyectora: Consiste en una válvula de seis vías que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Se producen pequeñas cantidades de muestra (0.1-100μL)
-

Columna: Se produce la separación de los componentes. Son, generalmente de Acero inoxidable, con una longitud de 10-30

cm y un diámetro interno de 4-10mm. De 1-10μm tamaño particula-40,000-60,000 platos/metro. PRECOLUMNAS  Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión y contaminantes de las disolvente.  La composición del relleno debe ser semejante a la columna analítica
-

Detector: Produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y esa señal es enviada al registrador. Deben de tener un volumen interno pequeño para reducir el ensanchamiento de pico. Basados en una propiedad de la fase móvil (refracción, densidad etc.) y en una propiedad del soluto (absorbancia en UV, fluorescencia etc.) Registrador Integrador: Realiza un gráfico de intensidad en función del tiempo (cromatograma) que idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. Este que El integrador calcula además el área correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia

-

3.1.- Características de la Fase Estacionaria:
 

Puede ser alúmina, sílice o resinas de intercambio iónico. Para que el líquido inmovilizado sea útil debe poseer diferentes coeficient5es de participación con los solutos.

Para que un soluto presente un tiempo de residencia razonable en la columna, debe poseer por lo menos, una cierta compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria.  Entre solutos de polaridad similar, el orden de elusión generalmente sigue al orden de puntos de ebullición; cuando éstos difieren suficientemente son factibles separaciones limpias.  Los solutos con puntos de ebullición casi idénticos, pero de diferentes polaridades, retendrán selectivamente uno o más de los componentes por interacción dipolo o por formaciones de abducto

3.2.- Características de la Fase Móvil: Es un solvente líquido, el cual puede ser puro o una mezcla de solventes.  El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos.  El líquido, se obliga a pasar a través del sólido bajo presión o bien se deja percolar a través de él, por efecto de la gravedad.

3.3.- Características estacionaria de HPLC

del

soporte

ideal

en

la

fase

La función básica del soporte es la de “mantener” (sotener, retener) la fase estacionaria  La mayoría d elos soportes cromatográficos está hecha de diatomita. Químicamente es casi todo sílice, con algunas impurezas. 4.- Enumere los tipos de detectores utilizados en HPLC: Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en: • Detectores basados en una propiedad de la fase móvil . Ejemplo: Detector de Indice de Refracción • Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta Los detectores más utillizados en HPLC son: • Detector UV. Hay básicamente tres tipos: o Detector de Longitud de Onda Fija o Detector de Longitud de Onda Variable o Detector de Arreglo de Diodos • Detector de Indice de Refracción. Existen muchos diseños de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos: o Tipo Deflexión o Tipo Fresnel

Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización . Detector de Fluorescencia Inducida por Laser o Según la Fuente de Excitanción o Según el sistema óptico Detectores Electroquímicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: o Detector Amperométrico o Detector Conductimétrico o Detector Potenciométrico

5.- Establezca diferencia entre una separación isocrática y separación con gradiente: En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatogràfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos. Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua, mientras que los compuestos más

hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas por tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos. 6.- Cómo afectan los siguientes parámetros en la Resolución de la columna:

 Diámetro de la partícula:
La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una mayor superficie y una mejor separación, pero la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad, aumentaría la resolución de la columna, pero a la vez, aumentaría la presión necesaria en un factor de ocho.

 Longitud de la columna:
Es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. Las columnas de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificación de compuestos para su utilización posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de rango analítico y normalmente están asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar, con un diámetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometría de masas. 7.- Enumere las aplicaciones de la HPLC  Compuestos iónicos, como aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos orgánicos, etc.  Compuestos de alto peso molecular, como polímeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.  Compuestos termolábiles y no volátiles, como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros productos farmacéuticos.  Análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto tiempo.

 Determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos (nucleótidos, nucleósidos) por cromatografía de intercambio iónico.  Determinación de esteroides.  El análisis de medicamentos (determinación de los componentes activos de una tableta analgésica, análisis de barbitúricos, anticonceptivos, etc).  En separaciones según el tipo químico, ya que su finalidad no es la separación de compuestos individuales, sino de grupos diferentes de sustancias presentes en las mezcla.

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