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República Bolivariana de Venezuela

Universidad del Zulia


Facultad de Medicina
Escuela de Bioanálisis
Cátedra: Análisis Instrumental

Técnicas Cromatográficas

Maracaibo, 24 de Julio de 2008


Cromatografía de Gases:
1. Estudie las definiciones y términos siguientes
 Cromatografía
 Cromatograma
 Elusión
 Fase Móvil
 Tiempo de Retención
 Ancho de base
 Fase Estacionaria
 Altura del plato teórico.
 Eluyente
 Resolución
 Tiempo muerto
 Números de platos teóricos
2. Establezca diferencias entre los métodos de Cromatografía de
Gases
 Cromatografía de Gases
 Cromatografía de Líquidos
3. Identifique los componentes generales de un Cromatógrafo de
Gas y estudie la función de cada una de ellas.
4. Clasifique los diferentes detectores utilizados en Cromatografía
de Gases.
5. Enumere las características de la Fase Estacionaria y Fase Móvil
en Cromatografía de Gases
6. Como es normalmente un Cromatógrama en Gases.
7. Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la
Cromatografía de Gases
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)
1. Describa el fundamento de HPLC
2. Establezca la clasificación de los tipos de HPLC
3. Elabore un esquema con los componentes esenciales de un
Cromatógrafo líquido, y estudie la función de cada uno de ellos.
 Enumere las características de la Fase Estacionaria
 Enumere las características de la Fase Móvil
 Establezca las características del soporte ideal en la fase
est5acionria de HPLC.
4. Enumere los tipos de Detectores usados en HPLC
5. Establezca diferencia entre separación isocrática y separación
con gradiente
6. Como afecta los siguientes parámetros en la Resolución de la
columna:
7. Enumere las aplicaciones de la HPLC
1.-Estudie las definiciones y términos siguientes:

1.1.- Cromatografía: Es un conjunto de técnicas basadas en el


principio de retención selectiva cuyo objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla y en algunos casos identificar estos si es
que no se conoce su composición.
La cromatografía es la técnica que separa una mezcla de solutos
basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos
que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o
gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase
estacionaria, la cual puede ser sólida o líquida.

1.2.- Cromatograma: Es una gráfica u otro tipo de presentación de


la respuesta de un detector, la concentración de un analito en el
efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en
el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo.
Registro producido por el cromatógrafo de gas / líquido. Es también
una medida del funcionamiento del instrumento.

1.3.- Elución: Es el procedimiento en el que la fase móvil se pasa de


forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la
muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una
pequeña cantidad en un tiempo breve.

1.4.- Fase Móvil: Puede ser un líquido o un gas que recorre la


columna cromatográfica transportando los componentes de la
mezcla a través de dicho sistema.

1.5.- Tiempo de Retención: Es el tiempo transcurrido entre el


instante en que se introduce la mezcla y el instante en que se detecta
la señal propia del componente en su máxima intensidad. Los tiempos
de retención no son reproducibles, ni siquiera en una misma columna
cromatográfica.

1.6.- Ancho de Base: Es la separación de la longitud de las bases


interceptado por agentes delongados en el detector.

1.7.- Fase Estacionaria: Es la que recubre la columna


cromatográfica, interiormente sin desplazarse. La fase estacionaria
consiste en partículas, generalmente sólidas, pequeñas y con una
superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo
superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o
extendida en forma de capa.

1.8.- Altura del Plato Teórico: Se utiliza como una medida de la


eficiencia de la columna, este directamente relacionado con la
varianza, por ello resulta convenientemente medir la eficiencia de la
columna en los términos de varianza y longitud de la columna.

1.9.- Eluyente: Es aquella sustancia que se pone en contacto con la


fase estacionaria y permite que se desplace la muestra.

1.10.- Resolución: Es el parámetro que expresa el grado de


separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para
dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un
sistema cromatográfico para dos componentes. Se define como:

Donde Rs es la resolución, tRA y tRB son los tiempos de retención de


los componentes A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del
cromatograma de los anteriores componentes.

1.11.- Tiempo Muerto: Es el tiempo de retención del componente


inerte o gas portador.

1.12.- Número de Platos Teóricos: Se utiliza como una medida


eficiente de la columna.

2.- Establezca las diferencias entre los métodos de


Cromatografía de Gases.

En cromotografía de gases se incluyen todos los métodos


cromatográficos en los que la fase móvil es un gas (gas portador),
siendo la fase estacionaria un líquido (CGL) o un sólido (CGS).

 La cromatografía gas-sólido (CGS): Tiene una fase estacionaria


sólida en la cual se produce la retención de los analitos debido a
la adsorción física sobre la superficie del sólido. Esta técnica ha
tenido una aplicación limitada debido a la tendencia de los
picos de elución a formar colas y a la retención
semipermanente de gases activos sobre la fase estacionaria.
 La cromatografia gas-líquido (CGL): Se basa en la distribución
del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria
líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte
(soporte) o en las paredes interiores de la columna, si ésta es
capilar.

3.- Identifique los componentes generales de un


Cromatógrafo de Gas, y estudie la función de cada una de
ellas:
 Gas Portador: es un gas inerte, generalmente helio, nitrógeno o
argón, de elevado grado de pureza. El caudal del mismo que
pasa por la columna, ha de ser conocido y controlado. Cumple
básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la
muestra, y crear una matriz adecuada para el detector.
 Inyector: Es sólo una pequeña cámara colocada
inmediatamente antes de la(s) columna(s) de separación,
donde se accede mediante una jeringa adecuada o con una
válvula de inyección. El Inyector es el lugar por donde se
introduce una pequeña cantidad de muestra (del orden de 1
cm3 de gas o 1 micro-litro de líquido) en medio de la corriente
de gas. También se encarga de vaporizar las muestras cuando
éstas no son gaseosas. Así, la temperatura del inyector ha de
ser superior a la del punto de ebullición del componente de la
mezcla menos volátil.
 Columnas: El sistema de columnas cromatográficas constituyen
el corazón de todo cromatógrafo. Cada columna se diseña para
aprovechar alguna propiedad de los diferentes componentes
que resulte adecuada para generar distinta velocidades de
avance para cada uno de ellos durante el recorrido de la
columna. Existen dos tipos:
o Las columnas de relleno: Suelen ser de cobre, acero
inoxidable, aluminio, vidrio y teflón; con un diámetro
interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m.
La eficacia está en torno a 1.000-2.000 (platos
teóricos/m). Suelen emplearse para muestras poco
complejas, máximo 10 componentes.
o Las columnas capilares: Tienen un diámetro interior
inferior a 1 mm (320-250 μm) y una longitud de 5 a 50
m. Suelen construirse con sílice fundida que le dan
gran resistencia física y flexibilidad. Alcanzan una
eficacia hasta de 4.000 (platos teóricos/m) y se usan
para muestras complejas. La fase estacionaria se
depositada sobre las paredes interiores del tubo
capilar. Las columnas semicapilares tienen un diámetro
interior de 530 μm que admiten cantidades de muestra
similares a las columnas de relleno, y proporcionan
mayor eficacia que éstas.
 Detector: Es un dispositivo para revelar la presencia de las
sustancias eluídas a la salida de la columna cromatográfica.
Podemos expresar que el detector son los "ojos" de un
cromatógrafo. Es un dispositivo capaz de convertir una
propiedad física, no medible directamente, en una señal
elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y
magnitud de la propiedad física. El sistema de detección genera
una señal cuando un componente de la mezcla completa el
recorrido del sistema de separación.
 Un sistema de Integración: para cuantificar la señal generada
por cada componente en el Detector.
4.- Clasifique los diferentes detectores utilizados en la
cromatografía de Gases:

Estos pueden ser clasificados:

 Detectores según su Grado de Selectividad :


o Universales: Responde a la mayoría de los solutos que
pasan por él.
o Específicos ó Selectivos: Exhibe una gran respuesta a un
grupo particular de substancias con un mínimo de
respuesta a otras.
 Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificación,
obviamente, es en referencia a si la muestra es destruída o no.
 Detectores según su Modo de Respuesta:
o Dependientes del Flujo Másico: Producen una señal que es
proporcional a la cantidad de soluto que pasa a través de
él en la unidad de tiempo pero es independiente del
volúmen de gas portador requerido para la elución.
o Dependiente de la Concentración: Dan una señal
proporcional a la cantidad de soluto por unidad de
volúmen de gas portador que pasa a través de él.
• Detectores según el proceso de detección Ionización, Óptico-
espectroscópico, Electroquímico, etc.

5.- Enumere las características de la Fase Estacionaria y Fase


Móvil en Cromatografía de Gases:
Fase Estacionaria:

 Es la forma más habitual


 La fase estacionaria es no polar y la móvil es polar
 Utiliza disolventes no polares

Fase Móvil

 Es habitual
 Utiliza una fase estacionaria polar y una móvil no polar
 Utiliza disolventes polares

6.- Como es normalmente una Cromatografía de Gases.

La separación de los compuestos de una mezcla se realiza en las


siguientes etapas:

1.-Una vez elegida la columna y fase estacionaria, se ajustan las


temperaturas de la cámara de inyección, columna y detector, así
como el caudal de gas portador. Cuando la señal del detector es
constante (sin ruidos la línea base) se hace la inyección de la
muestra.
2.-Las muestras se inyectan en cantidades inferiores a 1 µl cuando
son líquidas y sobre 1 ml si son gaseosas; se introducen en la cámara
de inyección, donde se vaporizan, y son arrastradas hasta cabeza de
columna.
3.-Los componentes se fijan en una pequeña zona de la columna; por
equilibrios sucesivos entre fase móvil y estacionaria cada
componente se desplaza por la columna a velocidades diferentes.
4.-Finalmente, los solutos que salen de la columna, pasan al detector
y se obtiene el cromatograma.

7.- Enumere las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la


Cromatografía de Gases:

CUALITATIVAS
 Identificación Cromatográfica:
o Por Datos de Retención
o Por Serie Homólogas (Indices de Retención de Kovacs)
 Identificación No Cromatográfica:
o Análisis Clásicos
o Identificación por:
• Adición de Estándar
• Formación de Derivados
• Sustracción de un Componente
 Identificación con Técnicas Auxiliares: UV, IR, MS, RMN
CUANTITATIVAS
 Normalización de Área
 Normalización de Área con Factores de Respuesta
 Estandarización Externa
 Estandarización Interna

1.- Describa el fundamento de la HPLC:

La cromatografía líquida es una técnica cuyo objetivo es la separación


de los distintos componentes de una mezcla de sustancias,
basándose en las diferentes retenciones que experimentan los
componentes de la misma al pasar a través de una fase estacionaria,
cuando la muestra es eluida por una fase móvil líquida. Así, la
separación de los componentes de la muestra se produce debido a
sus interacciones entre una fase móvil líquida y una fase estacionaria
sólida, contenida en una columna cromatográfica.

Para explicar el fenómeno cromatorgráfico es necesario establecer


dos tipos de fundamento, uno remoto y otro próximo

Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o


algunas propiedades físicas o físico químicas de los analitos:
solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente
divididos), volatilidad, tamaño, carga, reactividad química o
bioquímica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una
situación experimental dinámica donde exhiben dos de estas
propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la
solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía
liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes:

- Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo


contacto entre si.
- El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas
completo posible.

Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy


improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo
par de propiedades físicas o físico - químicas frente a un sistema
cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser
muy pequeñas, se basa la separación cromatográfica.

2.- Establezca la Clasificación de los tipos de HPLC:

 Cromatografía de fase normal:

Fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la


química, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su
polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase
móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante
polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase
estacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta
la polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar
y la fase estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta
el tiempo de retención. La fuerza de interacción no sólo depende de
los grupos funcionales del compuesto de interés, sino también en
factores estericos de forma que los isómeros estructurales a menudo
se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes
más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los
compuestos mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a
aumentar el tiempo de retención.
 Cromatografía de fase reversa:

Consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad


moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo
de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una
cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17. El tiempo de retención es
mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las
moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. El tiempo de
retención aumenta con la adición de disolvente polar a la fase móvil y
disminuye con la introducción de disolventes más hidrofóbicos. La
cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo
denomina HPLC sin ninguna especificación adicional. La cromatografía
de fase reversa se basa en el principio de las interacciones
hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un
disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y
una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del
compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del
segmento apolar del analito expuesto al disolvente.Este efecto
hidrofóbico está dominado por la disminución de la energía libre de la
entropía asociada con la minimización de la interfase compuesto-
disolvente polar. El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de
disolvente apolar a la fase móvil. Esto modifica el coeficiente de
partición de forma que el compuesto se mueve por la columna y
eluye.

Las características del compuesto de interés juegan un papel muy


importante en la retención. En general, un compuesto con una
cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retención mayor
porque aumenta la hidrofobicidad de la molécula. Aun así, las
moléculas muy grandes pueden ver reducida la interacción entre la
superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de
retención aumenta con el área de superficie hidrofóbica que suele ser
inversamente proporcional al tamaño del compuesto. Los compuestos
ramificados suelen eluir más rápidamente que sus isómeros lineales
puesto que la superficie total se ve reducida.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase móvil, otras modificaciones de


la fase móvil pueden afectar la retención del compuesto; por ejemplo,
la adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la
tensión superficial, y como que la entropía de la interfase compuesto-
disolvente está controlada precisamente por la tensión superficial, la
adición de sales tiende a aumentar el tiempo de retención.

Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la


hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayoría de
métodos utilizan un tampón como el fosfato de sodio por controlar el
valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero también
neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria
que haya quedado expuesta y actúan como contraiones que
neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre
la cromatografía puede variar, pero en general mejoran la separación
cromatográfica.

Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad


que las columnas de silica normales. Aun así, muchas columnas de
fase reversa están formadas por silica modificada con cadenas alquil
y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que
éstas podrían dañar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas
se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso pero no deberían estar
expuestas demasiado tiempo al ácido porque puede corroer las partes
metálicas del aparato de HPLC.

 Cromatografía de exclusión molecular

También conocida como cromatografía por filtración en gel, separa las


partículas de la muestra en función de su tamaño. Generalmente se
trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se suele
utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También es
muy útil para la determinación de la estructura terciaria y la
estructura cuaternaria de las proteínas purificadas.

La cromatografía de filtración molecular es un método de


cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan en
solución según su peso molecular, o más precisamente, según su
radio de Stokes.

En esta cromatografía, la fase estacionaria consiste en largos


polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A
los fines prácticos, la columnas se empaquetan con pequeñas
partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados.
En consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los
poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no
podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente
pequeñas) podrán pasar libremente. Los poros quedan conectados
formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a
ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta.

 Cromatografía de intercambio iónico:

En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la


atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas
inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son
excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la
columna. Algunos tipos de intercambiadores iónicos son: i) Resinas de
poliestireno, ii) intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos
(geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamaño de poro controlado. En
general los intercambiadores iónicos favorecen la unión de iones
elevada carga y radio pequeño. Un incremento en la concentración
del contraión (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el
tiempo de retención. Un incremento en el pH reduce el tiempo de
retención en las cromatografías de intercambio catiònico mientras
que una disminución del pH reduce el tiempo de retención en las
cromatografías de intercambio aniònic.

 Cromatografía basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias


biológicamente activas de formar complejos estables, específicos y
reversibles. La formación de estos complejos implica la participación
de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals,
interacciones electrostáticas, interacciones dipolo-dipolo,
interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno entre las partículas
de la muestra y la fase estacionaria.

3.- Elabore un esquema con los componentes esenciales de un


Cromatógrafo líquido, y estudie la función de cada uno de
ellos.

Un equipo para cromatografía líquida de alta resolución puede


representarse por el siguiente esquema:
- Bomba: Envía al solvente a través de caños de diámetro
pequeño, generalmente de acero inoxidable. El sistema de
bombeo debe seguir los siguientes requerimientos:

1. Generación de presiones por encima de 6000 psi(~410 atmósferas)


2. Flujo libre de pulsaciones
3. Intervalo de caudales de 0.1 a 10 ml/min(con control del 0.5%)
4. Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable o Teflón)
5. Reproducible

Tipos de Bombas:
• Bombas reciprocas
• Bombas de desplazamiento
• Bombas neumáticas
- Válvula Inyectora: Consiste en una válvula de seis vías que
permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida
en un aro o loop de volumen calibrado. Se producen pequeñas
cantidades de muestra (0.1-100μL)

- Columna: Se produce la separación de los componentes. Son,


generalmente de Acero inoxidable, con una longitud de 10-30
cm y un diámetro interno de 4-10mm. De 1-10μm tamaño
particula-40,000-60,000 platos/metro.

PRECOLUMNAS
 Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en
suspensión y contaminantes de las disolvente.
 La composición del relleno debe ser semejante a la columna
analítica

- Detector: Produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad


de materia y esa señal es enviada al registrador. Deben de
tener un volumen interno pequeño para reducir el
ensanchamiento de pico. Basados en una propiedad de la fase
móvil (refracción, densidad etc.) y en una propiedad del soluto
(absorbancia en UV, fluorescencia etc.)

- Registrador Integrador: Realiza un gráfico de intensidad en


función del tiempo (cromatograma) que idealmente, se trata de
picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de
la muestra original. Este que El integrador calcula además el
área correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la
cantidad de sustancia

3.1.- Características de la Fase Estacionaria:

 Puede ser alúmina, sílice o resinas de intercambio iónico.


 Para que el líquido inmovilizado sea útil debe poseer
diferentes coeficient5es de participación con los solutos.
 Para que un soluto presente un tiempo de residencia
razonable en la columna, debe poseer por lo menos, una
cierta compatibilidad (solubilidad) con la fase estacionaria.
 Entre solutos de polaridad similar, el orden de elusión
generalmente sigue al orden de puntos de ebullición;
cuando éstos difieren suficientemente son factibles
separaciones limpias.
 Los solutos con puntos de ebullición casi idénticos, pero
de diferentes polaridades, retendrán selectivamente uno o
más de los componentes por interacción dipolo o por
formaciones de abducto

3.2.- Características de la Fase Móvil:

 Es un solvente líquido, el cual puede ser puro o una


mezcla de solventes.
 El tiempo de retención aumenta con la adición de
disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la
introducción de disolventes más hidrofóbicos.
 El líquido, se obliga a pasar a través del sólido bajo presión
o bien se deja percolar a través de él, por efecto de la
gravedad.

3.3.- Características del soporte ideal en la fase


estacionaria de HPLC

 La función básica del soporte es la de “mantener”


(sotener, retener) la fase estacionaria
 La mayoría d elos soportes cromatográficos está hecha de
diatomita. Químicamente es casi todo sílice, con algunas
impurezas.

4.- Enumere los tipos de detectores utilizados en HPLC:

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:


• Detectores basados en una propiedad de la fase móvil .
Ejemplo: Detector de Indice de Refracción
• Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar.
Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta
Los detectores más utillizados en HPLC son:
• Detector UV. Hay básicamente tres tipos:
o Detector de Longitud de Onda Fija
o Detector de Longitud de Onda Variable
o Detector de Arreglo de Diodos
• Detector de Indice de Refracción. Existen muchos diseños de
estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos:
o Tipo Deflexión
o Tipo Fresnel
• Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede
detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o
inducida por derivatización .
• Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
o Según la Fuente de Excitanción
o Según el sistema óptico
• Detectores Electroquímicos. Pueden ser clasificados en tres
tipos:
o Detector Amperométrico
o Detector Conductimétrico
o Detector Potenciométrico

5.- Establezca diferencia entre una separación isocrática y


separación con gradiente:

En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna


cromatogràfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un
cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas
características químicas en su superficie) mediante el bombeo de
líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra
a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes
se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones
químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan
por la columna. El grado de retención de los componentes de la
muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición
de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un
compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de
retención y se considera una propiedad identificativa característica de
un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La
utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la
velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su
difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la
cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol
y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o
compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la
separación de los compuestos.

Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación


en la composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como
elución en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de
fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de
forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía
en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los
componentes de la muestra como una función de la afinidad del
compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la
fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente
agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayor
concentración de agua, mientras que los compuestos más
hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A
menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas por tal de
optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de
los compuestos.

6.- Cómo afectan los siguientes parámetros en la Resolución


de la columna:

 Diámetro de la partícula:
La mayoría de HPLC tradicionales se realizan con una fase
estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. Estas
partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de
diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas ofrecen una
mayor superficie y una mejor separación, pero la presión que se
requiere por obtener una velocidad lineal óptima aumenta de forma
inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula. Esto
significa que disminuir la medida de las partículas a la mitad,
aumentaría la resolución de la columna, pero a la vez, aumentaría la
presión necesaria en un factor de ocho.

 Longitud de la columna:
Es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra que se
puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. Las
columnas de diámetro interno más grande (>10 mm) se utilizan
normalmente en la purificación de compuestos para su utilización
posterior. En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5
mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se
caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del
consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas se suelen
denominar columnas de rango analítico y normalmente están
asociadas a un detector UV-VIS. Aparte, existen otros tipos de
columnas, como las de tipo capilar, con un diámetro inferior a 0.3
mm, utilizadas principalmente en espectrometría de masas.

7.- Enumere las aplicaciones de la HPLC

 Compuestos iónicos, como aminoácidos, sales inorgánicas,


ácidos orgánicos, etc.
 Compuestos de alto peso molecular, como polímeros,
hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc.
 Compuestos termolábiles y no volátiles, como vitaminas,
pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y un producto
muy grande de otros productos farmacéuticos.
 Análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto
tiempo.
 Determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos
(nucleótidos, nucleósidos) por cromatografía de intercambio
iónico.
 Determinación de esteroides.
 El análisis de medicamentos (determinación de los
componentes activos de una tableta analgésica, análisis de
barbitúricos, anticonceptivos, etc).
 En separaciones según el tipo químico, ya que su finalidad no
es la separación de compuestos individuales, sino de grupos
diferentes de sustancias presentes en las mezcla.