Cromatografía en capa fina y en columna

Leonel García Valle

Introducción
La cromatografía comprende un conjunto de técnicas que tienen como finalidad la separación de
mezclas basándose en la diferente capacidad de interacción de cada componente en otra
sustancia. De forma general, consiste en pasar una fase móvil (una muestra constituida por una
mezcla que contiene el compuesto deseado en el disolvente) a través de una fase estacionaria fija
sólida. La fase estacionaria retrasa el paso de los componentes de la muestra, de forma que los
componentes la atraviesan a diferentes velocidades y se separan en el tiempo. Cada uno de los
componentes de la mezcla presenta un tiempo característico de paso por el sistema,
denominado tiempo de retención. Cuando el tiempo de retención del compuesto deseado difiere
del de los otros componentes de la mezcla, éste se puede separar mediante la separación
cromatográfica.

Fundamentos
La separación de los diferentes componentes de una mezcla que se encuentran en un líquido o
gas es el resultado de las diferentes interacciones de los solutos a medida que se desplazan
alrededor o sobre una sustancia líquida o sólida (la fase estacionaria). Las diversas técnicas para
la separación de mezclas complejas se fundamentan en la diversidad de afinidades de las
substancias por un medio móvil gas o líquido y un medio absorbente estacionario (papel, gelatina,
alúmina o sílice) a través del cual circulan.

Cromatografía en capa fina

La cromatografía en capa fina se basa
en la preparación de una capa,
uniforme, de un adsorbente mantenido
sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Los requisitos esenciales son,
pues, un adsorbente, placas de vidrio,
un dispositivo que mantenga las
placas durante la extensión, otro para
aplicar la capa de adsorbente, y una
cámara en la que se desarrollen las
placas cubiertas.

Una placa de capa fina es una lámina

de vidrio, metal o plástico recubierto
con una capa delgada de un sólido
adsorbente (ge sílice o alúmina). Se
deposita una pequeña cantidad de la
muestra problema en disolución en un
punto en la parte inferior de la placa.
Entonces la placa se introduce en una
cubeta cromatográfica, de forma que sólo la parte inferior de la placa queda sumergida en el
líquido. En este líquido o eluyente es la fase móvil y asciende por la placa de capa fina por
capilaridad.

Cromatografía en columna
La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte
sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3)).
La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la
columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por efecto de la
gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto
adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que
cada uno de los componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase
estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su
separación. Así, de manera similar a otros tipos de cromatografía, las diferencias en las
velocidades de desplazamiento a través del medio sólido se corresponden con diferencias en los
tiempos de elución por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la
muestra original, que se recogerán en fracciones diferentes.

La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes
de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes
polares compiten más eficientemente con las moléculas
polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente.
Por lo tanto, un disolvente polar desplazará las moléculas,
incluyendo las más polares, rápidamente a través de la
columna. Si el disolvente es muy polar la elución será muy
rápida y generalmente habrá poca separación de los
componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es
muy apolar, no eluirán los compuestos de la columna. Por lo
tanto, la elección del eluyente es crucial para el éxito de la
cromatografía en columna. A menudo se utiliza un gradiente
creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para
determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada
separación.

Cálculo del factor de retención Rf

Cuando son visibles, se puede determinar para cada una de

las manchas el valor de Rf (factor de retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en
la placa. Cada compuesto tiene un Rf  característico que depende del disolvente empleado y del
tipo de placa fina utilizada, pero es independiente del recorrido del disolvente. De esta manera se
puede ayudar a identificar un compuesto en una mezcla al comparar su Rf con el de un compuesto
conocido.

Visualización de las manchas

Si los compuestos son coloreados se pueden observar las manchas a simple vista. Si no es así,
hay varios métodos para visualizar las manchas correspondientes a cada componente de la
mezcla.

1. Utilizar luz ultravioleta (UV254) para observar la placa. Normalmente se adiciona un

colorante fluorescente al adsorbente, de forma que la placa sea fluorescente en todas
partes excepto donde haya una mancha correspondiente a un compuesto orgánico.
2. Utilizar reveladores, por ejemplo, vapores de yodo que es un reactivo inespecífico.
 3. Emplear reactivos específicos para desarrollar coloración en las manchas. Esto se puede
hacer sumergiendo la placa de CCF en una disolución que los contenga o en forma de
spray.

Análisis de los eluatos de la columna

Si los compuestos separados en una cromatografía en columna son coloreados, el progreso de la

separación se puede monitorizar visualmente. No obstante, a menudo los compuestos que deben
ser aislados suelen ser incoloros. En este caso, se recogen secuencialmente pequeñas fracciones
de eluatos en tubos rotulados y la composición de cada fracción se analiza por cromatografía en
capa fina. Una vez identificadas las diferentes fracciones que contienen el mismo producto, se
reúnen, se elimina el disolvente y se analiza la identidad de los componentes por métodos
espectroscópicos.