INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS
INGENIERÍA BIOQUÍMICA

PRÁCTICA: TINCIÓN DE GRAM Y TINCIÓN DE ZIEHL - NEELSEN

INTEGRANTES:
GARCIA CRUZ NOELIA
MARTÍNEZ GONZÁLEZ GAMALIELY
GRUPO: 4IV1
FECHA: 12/10/2020PROFESORES:
SÁNCHEZ SÁNCHEZ ANTONIO
GERVASIO ORTIZ EMMANUEL ALEJANDRO
RETA MARES JOSÉ FRANCISCO
ESTEVA GARCÍA MARTHA ELENA
Tinción de Gram
Antecedentes

● 1884.

● Experimentos de coloración de bacterias.

● Tinción diferencial.

● Visualización de bacterias.

● Gram positivas (color violeta).

● Gram negativas (rojo).

Fig. 1. Hans Christian Gram.

 Fundamentos
20-80 nm
Bacterias por su
composición y estructura
de la pared celular.

Gram positivas a)

- Pared celular gruesa:

peptidoglucano.

Gram negativas 5-10 nm

- Pared celular delgada:
peptidoglucano.
- Membrana externa:
lipopolisacáridos. b)
Tórtora, G. J., [et.al], (2007)

Fig. 2.a) Pared celular Gram positiva. b) Pared celular Gram negativa.
Técnica
● Colorante primario
Cristal violeta.

● Mordente
Lugol.

● Decoloración
Alcohol-acetona (2:1)

● Colorante de contraste Fig.3. Los cocos (púrpura) son Gram

positivos y los bacilos (rosados) son
Safranina. Gram negativos.
Gram positivo Gram negativo

Fijación

Cristal violeta

Lugol

Alcohol- Acetona

Safranina
Objetivos

Realizar la técnica de coloración de Gram con especies bacterianas

conocidas.

Observar el efecto de algunas variaciones en la técnica de coloración.

 ➢ Colorante cristal violeta.
Materiales
➢ Asa bacteriológica.

➢ Lugol.

➢ Microscopio.
➢ Safranina.

➢ Portaobjetos. ➢ Alcohol-acetona.

Cepas:
➢ Escherichia coli
➢ Mechero Bunsen.
➢ Bacillus megaterium
➢ Staphylococcus aureus
Método

Preparación del frotis

Método

Chorro de agua
suave. Lugol durante 1
Cristal violeta minuto.
durante 1
minuto.

Chorro de agua suave.

Lavar.
Cubrir con safranina Chorro de agua Alcohol-acetona gota a
durante 1 minuto. suave. gota.
Resultados

Fig. 4. Escherichia coli (Gram negativas)

vistas al microscopio tras ser teñidas con Fig. 5. Bacillus megaterium (Gram
la tinción de Gram. (1000x) positivas) vistas al microscopio tras ser
teñidas con la tinción de Gram. (1000x)
Fig. 6. Staphylococcus aureus (Gram positivas)
vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción
de Gram. (1000x)
Video
Tabla de resultados

Microorganismo Morfología

Forma Agrupación Gram

Escherichia coli Bacilo corto Aislado Negativa

Bacillus megaterium Bacilo Cadena Positiva

Staphylococcus aureus Coco Racimo Positiva

Conclusiones
➔ La tinción de Gram es una técnica muy rápida que nos permite diferenciar
bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas.

➔ Las bacterias Gram negativas se diferencian de las Gram positivas por tener
una pared delgada peptidoglicana y una membrana externa.

➔ El paso de la decoloración con alcohol-acetona es un paso crítico para

obtener los resultados deseados, ya que demasiado tiempo haría ver a todas
las bacterias como Gram negativas y por el contrario, muy poco tiempo de
decolorante puede hacer verlas como Gram negativas.

➔ La edad de la cepa puede afectar los resultados, ya que con el tiempo pierden
capas de peptidoglucano, haciendo ver una Gram positiva como Gram
negativa.
Tinción de Ziehl - Neelsen
Antecedentes
Robert Koch.
En 1882 descubre a una bacteria con
forma de bacilo: Mycobacterium
tuberculosis.
- Tinción con azul de metileno y
café de Bismarck

Paul Ehrlich.
● Carácter ácido-alcohol resistente.
- Ácido nítrico, violeta de Fig. 7. Paul Ehrlich Fig. 8. Robert Koch
genciana en presencia de
anilina.
 Propone utilizar Cambió a la
ácido carbólico en genciana por fucsina
lugar de anilina. y utilizó ácido
sulfúrico en lugar del
ácido nítrico.

Fig. 9. Franz Ziehl Fig. 10. Friedrich

Neelsen
Fundamentos
● Bacterias ácido-alcohol
resistentes (BAAR).

● Bacterias no ácido-alcohol
resistentes (NAAR).

● Presentan alto contenido de

ácidos grasos (ácido
micólico).

● Identifica bacterias del género

Mycobacterium y algunas
especies de Nocardia,
Corynebacterium.

● BAAR - color rojo Fig. 11. Pared celular de las bacterias ácido alcohol
● NAAR - color azul resistentes (BAAR).
 Técnica
● Colorante primario
Fucsina fenicada

● Mordente
Calentamiento.
Lavado con agua fría.

● Decolorante
Alcohol - ácido (33:1)
Fig.12. Mycobacterium tuberculosis (Teñida
de Rojo) en un contraste (azul de metileno).
(1000x)
● Colorante de contraste
Azul de metileno.
BAAR NAAR

Fijación

Fucsina fenicada

Alcohol -
Ácido

Azul de metileno
Objetivos

● Realizar la técnica de coloración de Ziehl-Neelsen para la diferenciación de

bacterias ácido-alcohol resistentes.
Materiales
➢ Asa bacteriológica. ➢ Fucsina fenicada.

➢ Alcohol ácido.
➢ Microscopio.

➢ Azul de metileno.
➢ Portaobjetos.

Cepas:
➢ Mycobacterium phlei
➢ Mechero Bunsen. ➢ Staphylococcus aureus
 Método
Calentar por
1) Mycobacterium phlei 5 minutos.
2) Staphylococcus aureus
3) Mezcla.

Frotis. Fijar. Fucsina fenicada.

Lavar con chorro

de agua suave.
Azul de metileno
durante 1 minuto.

Lavar con chorro Lavar con chorro Decolorar con

de agua suave. de agua suave. alcohol ácido.
Resultados

Fig. 13. Microscopía de tinción de Ziehl-Neelsen

de Mycobacterium phlei (rojo) y Staphylococcus
aureus (azul). (1000x)
Video
Tabla de resultados

Microorganismo Morfología

Forma Agrupación Ácido alcohol

resistencia

Mycobacterium phlei Bacilo Aislado BAAR

Staphylococcus aureus Coco Racimo NAAR

Conclusiones

➔ La tinción de Ziehl Neelsen diferencia a las bacterias ácido alcohol resistentes

(BAAR), de las no ácido alcohol resistentes (NAAR).

➔ La pared de las BAAR presentan una concentración elevada de ácidos micólicos,

los cuales le confieren resistencia al alcohol ácido.

➔ El calentamiento no debe provocar la ebullición ya que esta desprende gases que

pueden ser tóxicos, además de provocar la precipitación del colorante.
Referencias

● Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2017). Introducción a la microbiología (12a
edición).. Editorial Médica Panamericana.
● Negroni, M. (2009). Microbiología estomatológica : fundamentos y guía práctica (2a
edición). Buenos aires. Editorial Médica Panamericana.
● Barrero Cuevas, L. (2016). Microbiología clínica. Editorial Síntesis.
● Martín González, A., Béjar, V., Gutiérrez, J. C., Llagostera Casas, M., & Quesada, E.
(2019). Microbiología esencial. Editorial Médica Panamericana.
● Prats, G., (2005). Microbiología clínica. Editorial Médica Panamericana.
● Zaragoza C. R. [et al]., (2007). Microbiología aplicada al paciente crítico. Editorial Médica
Panamericana.
● Forbes, B., (2009). Diagnóstico microbiológico. (12a edición). Editorial Médica
Panamericana
● Koneman, E.W…[et al]., (2008). Diagnóstico microbiológico. (6a edición). EDitorial Médica
Panamericana.