TINCION DE GRAM

04 /05/2016

ORDOÑEZ HERNANDEZ MIGUEL ANGEL

QUINTERO HERNANDEZ NELSON ENRIQUE

RODRIGUEZ PARRA CARLOS EDUARDO

BIOLOGA YESSICA POLO ALVARADO

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA DE SAN GIL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES E INGENIERÍA.

INGENIERÍA AMBIENTAL

SAN GIL

25/04/2016.
INTRODUCCIÓN

El principal impedimento en la observación de bacterias

en microscopio óptico es la falta de contraste entre la célula en observación y el medio que
la rodea, la manera más simple de facilitar el contraste es la utilización de colorantes,
revelando la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos,
esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Para bacterias, el
proceso de fijación por calor es lo más habitual, aunque también puede fijarse con
sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de esto se añade el
colorante. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por
el contrario, hace que las células parezcan mayores de lo que son realmente. La mayoría de
los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad por los materiales
celulares.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra
sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina
mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Una
técnica de coloración y la más conocida es la tinción de Gram, denominada así por
el bacteriólogo danés Christian Gram, quien desarrollo esta técnica en 1844. Sobre la base
dela tinción de gran, las bacterias se clasifican en dos grupos: gran positivos y gran
negativos. En cuanto a la tinción de gran la secuencia es la siguiente:

El frotis bacteriano se fija con calor se tiñe con cristal violeta por min, se lava con agua, se
la aplica un mordiente por 1 min y se lava nuevamente con agua, después se decolora con
una mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con safranina (color de contraste)
durante 1min lavar y secar. Las bacterias Gram positiva y Gram negativas tiñen de forma
distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La
pared de la célula bacteriana sirve para definir su tamaño y su forma al organismo así como
para prevenir la lisis osmótica. La pared dela células Gram positivas es gruesa y consiste en
varias capas interconectadas de péptido glucano.
La práctica se realizó en un laboratorio ya que se contaba con todos los elementos
requeridos y con las sustancias necesarias para realizar el procedimiento. Se realizó un
frotis bacteriano y se pudo observar por medio del microscopio y una pantalla la cantidad
de bacterias del que está compuesto el frotis realizado se aplica el fundamento de la tinción
de Gram y se interpretan los resultados.
OBJETIVO GENERAL

Conocer las técnicas de preparación y observación microscópica de bacterias.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Observar y diferenciar las bacterias Gram positivas y Gram negativas.

 Aprender a desarrollar de manera adecuada la tinción de Gram.
 Estudiar las características morfológicas de diferentes géneros de bacterias.
 Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram.
MARCO TEORICO

Tinción de Gram

Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se

manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza
dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y
bacterias Gram positivas. Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en
1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más utilizadas universalmente debido a
lo económico, sencillo y eficaz que resulta. En microbiología clínica resulta de gran
utilidad, ya que a partir de muestras clínicas directas provenientes de sitios estériles se
puede saber de manera rápida las características de la muestra y hacer una diferencia de los
potenciales microorganismos causantes de una infección. Los principios de la tinción de
Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias, la cual le
confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular de las
bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una
membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared
celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular
externa; así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared
celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las
características tintoriales. La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario
cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal
violeta por la formación de un complejo cristal violeta yodo que satura los espacios del
peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-
acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también
destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble
a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcoholacetona. Las bacterias Gram
positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este
complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad
de peptidoglicano. Por último, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante
secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el
complejo cristal violeta-yodo.

La tinción diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos químicos que se aplican en

secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado tinción primaria o
colorante primario. Su función es impartir color a todas las células. Con el objetivo de
establecer un contraste de color, el segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual
puede decolorar la célula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de
contraste, le da a las células decoloradas un color que contrasta con el del colorante
primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por células que no han perdido
el colorante primario. De esta manera, tipos de células o sus estructuras se pueden
distinguir unas de otras en función del colorante que es absorbido. El método de tinción
diferencial más importante usado en bacteriología es la tinción de Gram, llamada así en
honor al Dr. Hans Christian Gram.

Este método divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-
positivas. Esto es esencial para la clasificación y diferenciación de microorganismos. La
reacción a la tinción de Gram está basada en la diferencia en la composición química de la
pared celular bacteriana. Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de
peptidoglicano o mureína, mientras que esta capa es más fina en las Gram-negativas y está
rodeada por una bicapa lipídica externa. El Peptidoglicano es un polisacárido formado por
dos subunidades químicas, N-acetilglucosamina y ácido Nacetilmurámico.

Tinción Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tiñe todas las células moradas, aparte de
matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante primario con la célula, formando
complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el
color del teñido. Agente decolorante: Se utiliza alcohol etílico al 95%. El etanol tiene doble
función: deshidratante de proteínas y solvente de lípidos. El alcohol disuelve los lípidos de
la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared más porosa. De esta
manera, el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina más fina de las
bacterias Gram negativas, mientras que la pared más gruesa de las Gram-positivas retiene el
tinte en su interior. Tinción de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teñir de rojo
las células previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.
 EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS UTILIZADOS

MATERIALES Y EQUIPOS A UTILIZAR EN LA PRÁCTICA

CANTIDAD DESCRIPCIÓN

1 Asa de siembra o aguja enmangada

1 pinzas

1 Portaobjetos
1 Cubreobjetos
1 Cultivo bacteriano
1 Cubeta de tinción
1 Frasco lavador
1 Mechero Bunsen
1 Microscopio

Tabla 1

REACTIVOS A UTILIZAR EN LA PRÁCTICA

CANTIDAD DESCRIPCIÓN
1 Solución de cristal violeta al 1%

1 Solución de lugol
1 Solución alcohol-acetona

1 Solución de safranina al 0,5%

1 Papel de filtro

Tabla 2
 PROCEDIMIENTOS A REALIZAR

1. Preparar el frotis bacteriano.

2. Teñir con cristal violeta 1min,

luego Lavar con abundante agua el
exceso de colorante.

3). Cubrir con Lugol 1minuto luego

Lavar con agua el exceso de Lugol.

4).Decolorar con alcohol-acetona

o simplemente con alcohol hasta
que la preparación deje de perder
color, por (30seg), luego Lavar con
abundante agua para eliminar el
resto de disolvente.

5).Teñir con safranina 1minuto

luego Lavar con agua para
eliminar el colorante de
contraste.

*Secar la preparación, posteriormente examinar al microscopio fijándose sobre todo en el

color de cada preparación.
OBSERVACIONES

Figura: 1

Objetivo 4x

Se puede observar la existencia de bacterias, se observa de color purpura-violeta las

bacterias Gram + (Gram positivas) y las Gram- (Gram negativas) de color rojizo-rosado.
 Figura: 2

Objetivo 10x

Se puede distinguir unas bacterias de otras en función del colorante que es absorbido.
 Figura: 3

Objetivo 40x

Se puede observar el incremento de la afinidad de los colorantes Gram + (Gram positivas)

de color purpura-violeta y las Gram- (Gram negativas) de color rojizo-rosado, en las
bacterias.

Diplococos
Coco
bacilos

Figura: 4

Objetivo 100x

Se observa que las bacterias aparecen aisladas y agrupadas, además se observa la

morfología bacteriana de tipo cocos, cocos en cadenas, diplococos, coco bacilos, bacilos.

PREGUNTAS ADICIONALES
 1) ¿Qué tipos de morfología y agrupación aparecen en los frotis de los cultivos?

MORFOLOGIAS

 Macroscópica:

La mayoría de las bacterias se multiplican rápidamente y son visibles como colonias

cuando se las siembra en medios de cultivo sólidos adecuados. Requieren una incubación
de aproximadamente 24 horas en una atmósfera que favorezca su desarrollo, a temperatura
óptima. Existen excepciones como M. tuberculosis, que requiere para su desarrollo de dos a
ocho semanas de incubación.

 Microscópica:

La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular.
Básicamente se diferencian en su forma. Las bacterias pueden mantenerse unidas unas con
otras después de la división celular, pero conservando siempre la independencia celular.

2) ¿Qué fin tiene la fijación de muestras al realizar un frotis bacteriano?

La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y
adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles
agrupaciones de células que pudiera haber.

3) Señale las ventajas y desventajas de la tinción simple respecto del examen en fresco.
 PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO.
VENTAJAS DESVENTAJAS
-se puede verificar la existencia de - no es el más usado para observar la
bacterias y evidenciar su capacidad morfología bacteriana porque las bacterias
para moverse. tienen citoplasma incoloro y su índice de
- puede ser usado con técnicas refracción no difiere mucho del vidrio y del
especiales como la tinción con tinta agua.
china que nos permite determinar la
presencia de cápsula rodeando la - Hay características interesantes de los
bacteria. microorganismos que no son observables de
- puede usarse en el microscopio de este modo
campo oscuro por ejemplo para
observar Treponemas o Leptospiras
con su movimiento característico.
- Algunas son preparaciones que se
elaboran de forma rápida, simple y
económica.

-Observación de determinados
fenómenos microscópicos, tales como
división celular (células animales,
levaduras, etc.) o formación de
esporas.
Tabla 3

Conclusiones
Se comprendieron las funciones de dichos reactivos utilizados y
procedimientos realizados para llegar a la visualización de bacterias atreves
del microscopio.

La tinción de Gram permite conocer la morfología celular, el tamaño, la forma

y su clasificación taxonómica (Gram positivos o Gram negativos) de acuerdo
al color que tornan las bacterias después de la tinción.

Se pueden tomar conclusiones del tipo de bacteria observada basándose en la

teoría estudiada.

Se concluye que la toma de tiempos no exactos puede ser un factor contra para
el éxito de la práctica.

BIBLIOGRAFIA
http://www.pucmmsti.edu.do/websise/estudiante/materias/201220132/ST-BIO-231-P-
071/BIO-231%20PRACTICA%202%202-12-13.pdf

http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

Anexo de asistencia