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Universidad Autónoma Gabriel Rene Moreno

Materia: Biotecnología

Título de laboratorio: Tinción de Gram

Nombre: Herick Alexis Murillo Castro

Registro: 217062865

Carrera: Ingeniería química

Docente: Ing.Orlando Pedraza

Auxiliar: Jhon Wilmar Albino Apodaca

Semestre I – 2021
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1.- Objetivos:

- Diferenciar las Tinciones de Gram positivas de las Tinciones de Gram negativas.

- Realizar la visualización de las tinciones bacterianas para su posterior observación al

microscopio.

- Conocer las diferentes técnicas de Tinciones de Gram.

2.- Fundamento teórico:

2.1. Tinción de Gram:

Es una técnica que consiste en aplicar muestras colorantes a muestras biológicas, para

poder observar, diferenciar los tipos de bacterias, permite identificar la morfología celular de

las bacterias ya sea Gram positivo o Gran negativo. La diferenciación se fundamenta en la

composición de la pared:

Las principales características para que las bacterias gram negativas no se tiñan de cristal

violeta son que contienen un peptidoglicano delgado, y lipopolisacaridos en su membrana

externa lo que impide que las bacterias gram negativas adquieran la coloración.

2.2. Aplicaciones de colorantes orgánicos en la industria:

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- Ayudan a reducir la contaminación de cuerpos de agua ocasionados por las industrias

textileras.

- Su color característico es el rojo que se aplica para dar color a algunos alimentos como la

manzana, golosinas, frituras y refrescos.

2.3. Bacterias gran (+)

Se la denomina así porque tiene una capa gruesa denominada “peptidoglicano”. Su color

característico es el violeta morado. En el microscopio se los puede observar de las siguientes

formas:

- Bacilos: Bacterias alargadas.

- Cocos: Bacterias redondas

Estructura de la Staphylococcus catalasa (+):

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Estructura de la Staphylococcus catalasa (-):

- Bacilos filamentosos: Bacterias alargadas que le pueden salir brazos.

Bacterias gram (-):

- Caracteristicas:

- Bacilos o cocobacilos Gram negativos, anaeróbicos, facultativos, no esporulados.

- Colonizadores habituales del tracto intestinal de hombres y animales.

- Distribuidas en suelo, agua, alimentos y plantas.

- 40 generos y 150 especies.

- 20 especies responsables del 95% de las infecciones.

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- Infecciones nosocomiales.

Las bacterias gram negativas se tiñen de rojo cuando se utiliza este proceso. Las bacterias

gram negativas están encerradas en una cápsula protectora. Esta cápsula ayuda a evitar que los

glóbulos blancos (que combaten las infecciones) ingieran las bacterias. Bajo la cápsula, las

bacterias gram negativas tienen una membrana externa que las protege contra ciertos

antibióticos, como la penicilina. Al deteriorarse, esta membrana libera sustancias tóxicas

llamadas endotoxinas, que contribuyen a la gravedad de los síntomas en las infecciones por

bacterias gram negativas.

- Estructura:

2.4. Tinción de Wright

Esta técnica se aplica en citología para visualizar las células sanguíneas en concreto los

glóbulos blancos, ya que no contienen color. Es una tinción policromatica (que va colorear los
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distintos tipos de células que forman los glóbulos blancos. Es la combinación de dos

componentes: acidos (eosina) y básico (azul de metileno) en una solución alcohólica. Esta

técnica mantiene constante los niveles fijos de pH de la solución.

Resultado de la técnica.

Método del Frotis.

2.5. Tinción de Ziehl – Neelsen

Se basa en la propiedad que presentan algunas bacterias de resistir la decoloración con

ácido, después de ser coloreadas con carbolfucsina.

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La coloración básica de Ziehl- Neelsen requiere calentamiento para que el colorante

atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con

agua, provoca una nueva solidificación de los acidos grasos de modo que el colorante ya no

puede salir de las bacterias.

Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinetica de las moléculas del colorante

lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración

son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como

tinción de contraste.

2.6. Tinción negativa

La tinción negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el fin de

rodear y delinear las bacterias no teñidas u otros materiales biológicos.

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La tinción negativa es una método de colaboración especial para destacar la presencia de la

capsula en algunos microorganismos provenientes de muestras clínicas o de cultivos puros.

Esta técnica se la denomina así porque actúa de forma contraria al resto de las técnicas de

coloración. En esta lo que queda sin teñir es la estructura que se está buscando o se desea ver,

es decir, los microorganismos. Generando así el contraste suficiente como para permitir su

visualización al microscopio. Es una técnica de microscopía que permite contrastar las

muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones

(microscopía electrónica).
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3.- Materiales, equipos y reactivos:

Materiales Equipos Reactivos Colorantes

Porta-objetos (Donde
Safranina (Colorante
serán añadidos los 3
Diferenciador)
Alcohol etílico
colorantes y un
(Decolorante)
decolorante.

Microscopio Optico

Donde se visualizara
Mechero de alcohol
las bacterias y observar
(Donde se seca la Lugol (Colorante
las bacterias gram
muestra por el calor). mordiente)
positivas y las bacterias

gram negativas.

Asa de siembra
Cristal violeta
(esterilizador)
(Colorante

principal).
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Aceite de inmersión

(Se coloca en el

porta-objetos previo

a su visualización).

4.- Cálculos:

Aumento = [ ] * 10

Para el yogurt: 40x

Aumento = [ ] * 10

Aumento = 40 es la cantidad de veces que se visualizara el yogurt.

5.- Desarrollo de la experiencia:

Alistamos los colorantes correspondientes.

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Se hace un frotis con las Se esteriliza el asa de siembra

bacterias que se van a teñir. con el mechero de alcohol.

Se toma una muestra de Nuevamente se fija las bacterias con

cultivo sólido y se hace pasar el el calor para secar.

asa.

Se añade el colorante cristal Se lava el porta objetos para limpiar el colorante

violeta y se espera que actúe por con agua destilada.

1 minuto.
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Se añade el Lugol que actúa Se añade el alcohol que actúa como

como mordiente por 30 segundos decolorante por 15 segundos y se lava

y se lava nuevamente. con abundante agua.

Se añade el colorante de la Safranina Se seca la preparación de la muestra.

y se deja reposar por 2 minutos.

Se añade aceite de inmersión Se procede a la visualización de las

al portaobjetos bacterias.

Se obtuvo resultados de la

visualización de los Bacilos gram

positivos y negativos.
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6.- Conclusión:

Identificamos las bacterias que no se tiñen mediante la Tinción de Gram debido a los

componentes de su pared celular.

Con la observación del microscopio se logró diferenciar las Tinciones de Gram positivas y

negativas.

7.- Observaciones:

- Para los diferentes métodos de las tinciones, se utilizaba un colorante característico para

diferenciar las bacterias.

- La tinción de gram positivo absorbe más tinte o colorante que el gram negativo por lo que

resulta más sencillo decolorar.

- La tinción de gram se aplicó en una muestra de yogurt donde vimos un pequeño

porcentaje de bacterias gram negativos.

8.- Cuestionario:

8.1. ¿Por qué se les atribuye gran positivo y negativo?

- El gram positivo es una bacteria menos dañina para la salud mientras que el gram

negativo

- El peptidoglicano es grueso en gram positivo y delgado en gram negativo.

- El gram positivo no posee membrana celular externa, el gram negativo si posee

membrana celular externa.

8.2. Explique la participación y función de cada colorante.

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- Cristal violeta: Se encarga de colorizar los microorganismos a un mismo tono

- Lugol: Es un mordiente. Se encarga de intensificar el color y se forma complejo violeta

yodo.

- Alcohol Etílico: Se encarga de decolorar los microorganismos.

- Safranina: Se encarga de la diferenciación de los microorganismos. Tiñe a los

microorganismos decolorados.

8.3. ¿Por qué tiene un margen de tiempo cada colorante y cuánto es el rango?

- Para el colorante de cristal violeta se deja actuar por 1 minuto para teñir las bacterias

gram positivas y bacterias gram negativas.

- Para el colorante del Lugol se deja actuar por 30 segundos, es un mordiente que fija el

colorante.

- Para el alcohol etílico se deja actuar por 15 segundos para que se produzca decoloración

de las bacterias gram negativas

- Para el colorante de la Safranina se debe esperar entre 1 o 2 minutos para teñir las

bacterias decolorantes

8.4. ¿Qué es un colorante aniónico y catiónico?

- El colorante anionico llamados colorantes ácidos, son solubles en agua aplicados en un

baño ácido y poseen tintes ácidos como SO3H y COOH y se aplican sobre lana, seda y nailon.

Son sales con el anión coloreado y la base incolora. Son derivados de grupos sulfónicos,

carboxilos o hidroxilos fenólicos.

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- El colorante catiónico son sales en las que la base, normalmente una amina, aporta el

color, mientras que la parte ácida es incolora. Es decir, son colorantes catiónicos. Tienen

apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN o ciertos componentes de la matriz

extracelular como los glicosaminoglicanos. La unión es por atracción eléctrica.

8.5. Explique la importancia de la Safranina en esta experiencia y responda sí, ¿Es

indispensable o no es indispensable en esta experiencia?

Si es importante el uso de la Safranina ya que es el colorante que da contraste a la muestra

y sobretodo la que va diferenciar las bacterias gram positivas y negativas.

8.6. Investigue las demás aplicaciones del Lugol.

- Se puede usar como un colorante para células, haciendo el núcleo celular más visible en

microscopías y para preservar muestras de fitoplancton.

- En una colposcopia, la disolución de Lugol se utiliza en la prueba de Schiller en busca de

tejido vaginal canceroso.

- Se puede usar la disolución de Lugol para observar la forma en la que la membrana

celular hace ósmosis, fagocitosis y difusión.

- Utilizado como oxidante para reconocer alimentos antioxidantes.

8.7. ¿Para qué ocupamos el mechero en toda la experiencia?

Con el calor del mechero se ocupó para secar la muestra, y también para fijar las bacterias.

8.8. Explique la importancia de la esterilización del asa de siembra y por cada cuanto

tiempo se debe esterilizar el asa de siembra.

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La esterilización es muy importante para tener una muestra más fija en la muestra y este

proceso se lo realiza por 10 segundos.

9.- Bibliografía:

- https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/5-general.php.

- https://en.wikipedia.org/wiki/Acid_dye.

- https://www.youtube.com/watch?v=znoqqYJwRTc

- https://www.youtube.com/watch?v=0kOZlDSLkEw

- https://www.youtube.com/watch?v=83Co-UXY0Ow

- https://www.youtube.com/watch?v=y65tZyaA3ZU

- https://www.youtube.com/watch?v=1nt_Y0fxS2A.

-https://www.msdmanuals.com/es/hogar/infecciones/infecciones-bacterianas-bacterias-

gramnegativas/introducci%C3%B3n-a-las-bacterias-gram-negativas.