PRACTICA No.

5 “TINCIÓN DE GRAM”

Introducción

El método de tinción diferencial más importante usado en bacteriología es

la tinción de Gram, llamada así en honor al Dr. Hans Christian Gram.

Este método divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas
y las Gram-positivas. Esto es esencial para la clasificación y diferenciación
de microorganismos. La reacción a la tinción de Gram está basada en la
diferencia en la composición química de la pared celular bacteriana. Las
bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o
mureína, mientras que esta capa es más fina en las Gram-negativas y está
rodeada por una bicapa lipídica externa. El Peptidoglicano es un
polisacárido formado por dos subunidades químicas, N-acetil glucosamina
y ácido Nacetilmurámico (Rodríguez, 2005)

La tinción diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos químicos que

se aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es
llamado tinción primaria o colorante primario. Su función es impartir color a
todas las células. Con el objetivo de establecer un contraste de color, el
segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar
la célula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de
contraste, le da a las células decoloradas un color que contrasta con el del
colorante primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por
células que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de
células o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en función del
colorante que es absorbido.

Objetivos

 Conocer y manejar la técnica de tinción de Gram de acuerdo con la

estructura celular de las bacterias Gram (+) y Gram (-).
Procedimiento

Tinción Gram

Lavar los
portaobjetos

Tomar una gota de

agua con el asa

Tomar inoculo y
homogenizar

Fijar el frotis

Agregar Cristal
violeta por 1 min

Enjuagar y escurrir

Añadir Lugol por 1

min

Enjuagar y escurrir

Añadir alcohol-
acetoma por 19 seg

Enjuagar y escurrir

Agregar safranina
por 30 seg

Lavar y escurrir

Dejar secar junto al

mechero
 Resultados

En la práctica obtuvimos un buen frotis debido a que cada una de las fases
como se muestra en la Fig. 1, 2 y 3 se efectuaron de la manera correcta
respetando los tiempos establecidos.

Fig.2 Frotis con Yodo Lugol.

Fig.1Frotis de la
muestra con cristal
violeta

Fig.4 Dejar secar los frotis junto

Fig.3Frotis con alcohol al mechero
acetona, puede observarse la
decoloración
Observación al microscopio

En la Fig.1, 2 y 3, debido a que no llevamos a cabo una buena tinción, se

observaba mucha cantidad de colorante y no se podía observar con
claridad la forma que estas tenían, pero en la Fig.4, pudimos observar con
mayor claridad el frotis, añadiendo a esto que el microscopio ya era uno
diferente y más preciso, observando como resultado Bacilos Gram (-)

Fig.1 Objetivo de 10X Fig.2 Objetivo de 10X

 Fig.4 Objetivo de 100X, con aceite de
inmersión
Bacilos Gram (-)

Reactivo Color observado

Cristal violeta Color morado oscuro
Lugol Café amarillento
Alcohol-acetona Incoloro
Safranina Rojo (rosa)

Discusión de resultados:

Lo que observamos en el microscopio de nuestro frotis fueron bacilos Gram

negativos, es decir, el color que poseen es rojo, y esto es debido a los
colorantes utilizados de los cuales cada uno cumple una función específica
en cada tipo de pared celular de la bacteria.

Cada solución agregada crea una cierta función, las cuáles son:

o El alcohol en las Gram – va a extraer los lípidos de la pared con lo cual

aumentan los poros de esa pared y sale el colorante de cristal violeta.
En la Gram+, que tienen menos lípidos, ocurre una deshidratación de
 la pared y por lo tanto disminuyen los poros de la pared, entonces no
sale el cristal violeta.

o La fucsina es un colorante de contraste, en las Gram – va a quedar

teñida de color rojo o rojizo y en las Gram + queda de color azul
(violeta).

o La Gram-, tienen gran cantidad de lípidos en su pared, el alcohol los

extrae, origina grandes poros en su pared y a través de ellos el
complejo cristal violeta – yodo, puede salir permitiendo que en su
lugar sea ocupado por el colorante fucsina tomando por tanto un
color entre rojo y rosado.

o La Gram+, al actuar el alcohol se produce deshidratación. Al

complejo cristal violeta – yodo debido a que disminuyen los poros de
la pared y quedan teñidos de color púrpura – violeta.

Conclusión:
El objetivo de la práctica se cumplió de manera satisfactoria, debido a que
durante la observación al microscopio pudimos percatarnos de la presencia
de bacterias Gram + y -.

Cuestionario

1.- ¿Qué importancia tiene la tinción Gram?

La importancia de la coloración de Gram como herramienta diagnóstica ya

que en primera instancia permite caracterizar tamaño, forma y/o
agrupación bacteriana.

El examen con microscopio óptico de preparación con tinción de Gram se

emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas
comunes son cocos (esféricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas. Las
bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los
microorganismos Gram positivos se tiñen de azul, mientras que
aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los
organismos espira lados se tiñen de rojo y se dice que son gramnegativos.

2.-Escribe 4 ejemplos de bacterias Gram (+) y (-)

Gram (-)
G. ESCHERICHIA. E. coli
G. SHIGELLA. S. dysenteriae, S. sonney
G. SALMONELLA. S. enterica
G. CITROBACTER. C. freundii
Gram (+)
G. MICROCOCCUS. M. luteus.
G. STAPHILOCOCCUS. S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus
G. STREPTOCOCCUS. S. pyogenes, S. pneumoniae

G. ENTEROCOCCUS. E. faecalis. Otros ESTREPTOCOCOS.

3.- Cite 3 razones por lo cual los microorganismos deben de teñirse

 Para conocer su morfología, definida por el tamaño, la forma, el

arreglo y la estructura de las bacterias en cuestión.
 Obtener información sobre la morfología y composición química de
las bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran
el uso de varios reactivos y éstas pueden diferenciarse con base al
color que retienen.
 Para obtener información de algún diagnostico en cuestión.
4.- ¿Por qué las bacterias Gram (-) se tiñen de rojo y las Gram (+) de color
azul?

Las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su

pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de
peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la
tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con
alcohol-acetona que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras
que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán
azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste
(safranina) para que puedan observarse.

Bibliografía

Rodriguez, E., & Galindo, J. (2005). Bacteriología General: Principios Y

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Stanier, R., & Villanueva, J. (1996). Microbiología. Google Books. Recuperado

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Vizcarrondo, M., & Gutiérrez, S. (2001). MORFOLOGÍA Y TINCIÓN DE LOS

MICROORGANISMOS. Recuperado 6 Abril 2016, de
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