COLORANTES Y COLORACIONES EN MICROBIOLOGIA

SECCIÓN DE POSTGRADO DE CIENCIAS DE LA COMUNICACIÓN

 OBJETIVOS
• Que el alumno aprenda las técnicas de preparación
de frotis, fijación y coloraciones más utilizadas en el
estudio microbiológico ya sea a partir de muestras
directas o de cultivos bacterianos.
• Identifique las diferentes formas bacterianas y de
importancia clínica.
• Conocer el fundamento de las respectivas
coloraciones asi como la aplicabilidad de las mismas.
FLUJOGRAMA DEL TRABAJO EN MICROBIOLOGIA MEDICA

MUESTRA

COLORACION Y
OBSERVACION IDENTIFICACION DEL
MICROSCOPICA AGENTE PATOGENO Y
DETERMINACION DE SU
SUSCEPTIBILIDAD A
CULTIVO ANTIBIOTICOS

ANTIBIOGRAMA
 ¿Por qué colorear las muestras?
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal (100 u- 10 5nm) que resultan
difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la célula y el campo microscópico , el medio más simple de aumentar el contraste es
la utilización de colorantes.

IMPORTANCIA
Gracias a las tinciones podemos examinar mejor la forma y el tamaño de los microorganismos lo
cual es tarea difícil en una observación directa.
Nos permite además, por medio de tinciones especiales, estudiar diferentes estructuras de las
células tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células
 Colorantes

Son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste poseen:

grupo cromóforo que otorga color a la molécula y

grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de disociarse

electro-líticamente y por lo tanto formar sales, es el que facilita la unión
del colorante a otras sustancias con carga eléctrica.

Los colorantes más usados son sales, constituidas por

1. ion cargado positivamente
2. ion cargado negativamente
Por ejemplo, azul de metileno es actualmente la sal cloruro azul de
metileno.
 COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: más comúnmente usados
 básicos: Consisten en un catión coloreado unido a un anión
incoloro. Tiñen la célula bacteriana uniformemente (ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos )
 (cromatina nuclear de pro y eucariotas)
 (más usados en citología bacteriana).
• Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica,
el cristal violeta
 ácidos: Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado.
No tiñen la célula bacteriana, pueden usarse como color de
contraste (coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas
de las células eucariotas(Rx básicas)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo.
 COLORANTES: Tipos
b) Colorantes liposolubles
• Se combinan con los componentes lipídicos de
la célula, usados para revelar la localización de
los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.
 TIPOS DE TINCIONES

Pueden ser

SIMPLES DIFERENCIALES SELECTIVAS

•Un solo colorante •Más de un colorante •Uno o más colorantes

•Tiñe o no la célula •Células con diferente •Estructuras celulares
Ej.: •composición química con distinta composición
Azul de Metileno •Importancia taxonómica química
Safranina Ej.: Ej.:
Nigrosina Tinción GRAM Tinción de Esporas
Tinción AAR Tinción de Flagelos
Tinción de Paredes Cel.
Tinción de Corpúsculos
Metacromáticos
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA

a) Frotis o película (extensión)

b) La fijación

c) Coloración.
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA

a) Frotis o película (extensión)

• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
b) La fijación:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)
TIPOS
– CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)
– FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales
de etanol absoluto y éter)

Metanol
 Lunes
TINCIÓN SIMPLE DE AZUL DE METILENO: PROCEDIMIENTO
Frotis y fijación

2.- Tomar la muestra con el asa de 3.-Extender sobre el agua y fijar a la

MUESTRA siembra llama del mechero

Tinción

1.- Cubrir la preparación con Azul de 2.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio
Metileno 1’ Micrococcus
luteus
Observación de bacterias en muestras teñidas con coloración simple
(colorante Básico azul de metileno)

Observacion de
levaduras en
muestras teñidas con
coloracion simple
(colorante acido
Nigrosina)
 Lunes
Tinción negativa.

1.- Colocar una gota de Nigrosina

en un porta
3.- Mezclar con la
Nigrosina y extender por
2.- Tomar muestra del todo el porta. Secar al aire
microorganismo con el asa, y observar
flamear el tubo y tapar

cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas
 Lunes

Tinción
L-3.2.3.- Tinción de Gram
Frotis y fijación

MUESTRA

2.- Tomar la muestra con el 3.- Extender sobre el

asa de siembra agua y fijar a la llama del 1.- Cubrir la preparación 2.- Añadir Lugol
mechero con Cristal Violeta 1’ (mordiente) durante 1’

3.- Decolorar con Alcohol

4.- Lavar con agua 5.- Teñir con Safranina 1’ 6.- Lavar con agua, dejar
96º hasta que no suelte
colorante secar y observar al
microscopio
Coloración Gram
 Diferencias en las estructura de la pared celular en
Gram Positivas y Gram Negativas

Gram positiva Gram negativa

 Morfología Bacteriana
Bacterias Esféricas = Cocos

diplococos cocos en cadena Tetradas Sarcinas cocos en racimo

Bacterias Alargadas = Bacilos

Bacilo aislado diplobacilo bacilos en cadena empalizadas

bacilos lado con lado
o en figuras X Y V

Bacterias En Espiral = Espirilos

 Tinción GRAM: Bacterias Gram-Positivas
Cocos Gram-positivos
Racimos: forma típica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma típica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo

Tetradas: forma típica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos
• Gruesos: forma típica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma típica de Listeria sp

Ramificados: forma típica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

Tinción GRAM: Bacterias Gram-Negativas
Cocos Gram-negativos

• Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis

• También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos.

Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y

Campylobacter sp, como C. jejuni