AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE PETRÓLEO

Angélica Fontecha1, Carlos Guerrero, Alejandro Herrera, Diana Ruiz, Tania Tafur &
Jessica Velasco

Resumen

Palabras claves: petróleo, bacteria, microorganismo, microscopio, coloración,

Abstract

1
Servicio Nacional de Aprendizaje SENA .Vélez Santander Colombia. Tecnólogo en control Ambiental
Correo taticatafur@misena.edu.co
INTRODUCCIÓN

METODOLOGIA
Previo a la práctica se realizó la esterilización de los elementos de laboratorio y materiales
de trabajo antes y después de cada proceso.

Preparación del blanco: La esterilización del petróleo se llevo a cabo por medio de rayos
UV, se vertió una cantidad de petróleo en una caja petri y se llevo a la cámara de flujo
laminar durante un periodo de tres días.

Bioensayo: Se hizo un pre enriquecimiento con petróleo al 0.5% a partir de una muestra
de agua tomada en las gradas que comunican el Sena con el centro de Vélez, se tomaron
180ml de agua estéril en un frasco de vidrio estéril, se agregaron 180ml de agua estéril y
luego se agrego 20ml de agua de la muestra y con ayuda de una pipeta se agregaron 10ml
de petróleo, se tapo y por último se llevo a incubación por un periodo de 7 días a
temperatura ambiente.

Preparación del medio de cultivo LB (MILLER):Se disolvieron 9.25g de Agar LB en

250ml de agua esterilizada dentro de un elenmeyer, luego se agito con una varilla de vidrio
hasta diluirlo completamente luego se llevo a la plancha de calentamiento inicialmente a
140°C, luego a 250 °C y se dejo hasta punto de ebullición. Se dejo enfriar un poco y se
procedió a verterlo en 10 cajas petri que fueron esterilizadas, luego se dejaron 5 minutos
en la cabina extractora hasta que se solidificaran completamente y por último se
envolvieron en papel vinipel y se dejaron en refrigeración.

Aislamiento de microorganismos: Se tomo 1 caja petri con el medio de cultivo Agar LB la

cual estaba refrigerada, luego con ayuda de una pipeta se vertió 1ml de la muestra de
petróleo .se procedió a hacer la siembra utilizando la técnica de difusión en placa, con
ayuda de él asa de Drigalski se extendió la muestra homogéneamente hasta que fue
absorbida completamente por el medio de cultivo luego se rotulo y se llevo a la incubadora
a 37°C por 24 horas.

Fijación de la muestra: Se tomó una lámina portaobjetos y se le agrego una gota de agua
estéril en la parte central, posterior a esto, con el asa punta redonda tomo una muestra de
las colonias encontradas, luego se extendió sobre la lámina de manera uniforme, por
último se fijó la muestra mediante calor flameado (este procedimiento se realizo para cada
colonia)
Coloración de Gram: Para la coloración de Gram se utilizaron los reactivos Cristal violeta,
Lugol, Mezcla de alcohol –Acetona y Fucsina. Se realizó el siguiente procedimiento:
teniendo las muestras ya fijadas en la lámina porta objetos, se tomó el Cristal violeta y con
el gotero se extendió uniformemente sobre ella, dejándose actuar por un minuto y lavando
suavemente con agua de grifo, enseguida se tomo el Lugol, una vez extendido sobre la
muestra se dejo actuar por un minuto, y se lavo con agua de grifo, luego se extendió la
mezcla de alcohol acetona sobre la muestra ,se dejo actuar de 2 a 5 segundos y se lavo
nuevamente con agua de grifo. Por último se agrego la fucsina de igual manera sobre la
muestra, se dejo actuar por un minuto, se lavo con agua de grifo y se dejo secar a
temperatura ambiente.

Observación al microscopio: las tres muestras se observaron utilizando el microscopio en

los objetivos 5x, 10x, 40x y 100x, agregando una gota de aceite de inmersión en este último
objetivo.

RESULTADOS

Se obtuvieron 11 colonias en total con características y morfología distintas (Tabla 1). Los
resultados obtenidos por la coloración de Gram en la cada colonia fueron: en la colonia 1
se observaron cocos con una coloración azul violeta lo que corresponde a cocos Gram
positivos y se encuentran agrupados en forma de cadena (Fig1). En la colonia 2, se
evidenciaron bacilos de coloración rosado claro que corresponde a bacilos Gram negativos
agrupados en forma de racimos (Fig2). Y por ultimo en la Colonia 3, se observaron cocos
de coloración rosado claro que corresponde a cocos Gram negativos en agrupaciones en
forma de cadena y otros se encuentran dispersos (Fig3).

Tabla 1: Descripción morfológica de las colonias obtenidas

Características Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3

Macroscópicas
Forma Redonda Redonda Redonda
Color Blanca Amarilla transparente
Margen Lisa Lisa Lisa
Tamaño Mediano Grande Pequeña
Relieve Elevada Elevada Elevada
Textura Suave suave suave
 Identificación de bacterias

Fig. 1: Observación al microscopio en Fig. 2: Observación al microscopio en

Objetivo 100x. Cocos Gram positivos Objetivo 100x. Bacilos Gram negativos

Fig. 3: Observación al microscopio en

Objetivo 100x. Bacilos Gram negativos
 DISCUSIONES

La coloración de Gram tiñe las bacterias Gram positivas y Gram negativas de forma distinta
debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares.
(Santambrosio, Ortega & Garibaldi, 2009) lo que significa que la coloración se obtuvo por
la reacción de los reactivos con el material del la pared celular.

La única fuente del carbono fue el petróleo pero para asegurarse esto fue necesario hacer el
blanco
 CONCLUSIONES

La coloración es una técnica que se utiliza para clasificar las bacterias en Gram negativas
y Gram positivas.

La bacteria encontrada en la muestra del petróleo posiblemente pertenezca al género

Staphylococcus sp aeruginosas

La bacteria del género. Staphylococcus sp aeruginosa se clasifica como bacilo Gram

positivo

REFERENCIAS