INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS
Ingeniería Bioquímica Efecto de los colorantes sobre
Microbiología
Alumnos: el crecimiento de los
Soriano Camacho Valery microorganismos
Vázquez Miranda Miranda
Equipo 3
Profesores:

Antonio Sánchez Sánchez

Francisco Reta Mares

INTRODUCCI
ÓN
COLORANTE

Un colorante es un compuesto orgánico que al aplicarlo a

un sustrato le confiere un color más o menos permanente.
Un colorante se aplica en disolución o emulsión y el
sustrato debe tener cierta afinidad para absorberlo.

Sustancia capaz de absorber determinadas longitudes de

onda del espectro de luz, que se fijan en otras y las dotan
de color de manera estable ante factores físicos o
químicos como la luz y agentes oxidantes.
COLORANTE

•Compuesto orgánico, que

está constituido por un grupo
cromóforo y un auxocromo
unidos a un anillo bencénico.
 CROMÓFORO
 El cromóforo es por si solo el responsable del color.
 Dobles enlaces, conjugados: color
 Carecen de la capacidad de formar enlaces de disociación, unirse a fibras o tejidos por lo que no tiñe
 El color se remueve por medios mecánicos

C=N-N=C Azina
-C=C- -N = (Indámico)
-C=N- -C=S Tiocarbonilo
Tiazina
-C=O-  
- N = N - (Azo)
- NO2 (Nitro) cromóforo + un anillo bencénico = cromógeno (no tiñe)
Anillos Quinoideos
N = O (Nitroso)
 AUXOCROMO
 Proporciona la capacidad a un cromógeno de fijarse y teñir.
 Grupo que se ioniza
 Confiere propiedad de disociación electrolítica
 Formar sales-enlaces
• OH-
• H+
 Simple

Diferenciales
Tinciones de microbiología

Selectivas

Agentes selectivos en
medios de cultivo Eosina en agar EMB

Usos en microbiología
Indicadores de pH
Rojo de fenol, Rojo de metilo

Indicadores de oxido
reducción Azul de metileno, Resazurina

Agentes antimicrobianos
Cristal violeta
 Agentes antimicrobianos

Los colorantes derivados del trifenilmetano y acridina se usan como agentes antimicrobianos.
• Trifenilmetano: Verde de malaquita y cristal violeta son moderadamente bactericidas, pero no
tienen efecto sobre esporas.
• Acridina: Acriflavina, proflavina y naranja de acridina
 Derivados del Trifenilmetano

• Son mas susceptibles a las Gram(+) ; los Gram (-) suelen ser mas resistentes por su
membrana externa.
• Infiere en la síntesis de pared celular.
• Bloquean la conversión del acido UDP-acetilmuramico en UDP-acetilmuramil-péptido.
• Son efectivos para la desinfección de superficies que contengan restos de grasa y aceite.
Cristal violeta y Verde malaquita

• Es un agente conocido antiséptico y antifúngico

• Se utiliza en los hospitales para el tratamiento de graves quemaduras
y otras lesiones de la piel y las encías.
• En solución acuosa al 5% es útil en afecciones de la piel y la mucosa
• Más activos en bacterias Gram positivo y algunos hongos.
 Derivados de Acridina

• Mayor efecto sobre Gram (+), pero inactivos

contra Pseudomonas aeruginosa, Micobacterium
y las esporas bacterianas.
• Los colorantes interfieren con la síntesis de
ácidos nucleicos y proteínas
• La acridina se inserta entre dos bases sucesivas
del ADN y las separa físicamente, lo que provoca
errores en la duplicación del ADN.
• Forma un complejo DNA-acridina que interfiere
en la biosíntesis de los ácidos nucleicos
Azul de metileno
• Usado para tinciones y como indicador
• Usado como antiséptico y cicatrizante
Safranina
• Como método para la visualización de la placa bacteriana a nivel
dental.
Eritrosina + verde malaquita (nombre comercial "Displaque"): es un test
bicolor. Tiñe de azul la placa antigua (de más de tres días) y de rojo la placa
reciente.
Definiciones

• Bactericida : Provoca la muerte de las bacterias de manera

irreversible.

• Bacteriostático: Aquel que no destruye o mata las bacterias, pero si

detiene su crecimiento y permanece latente.
Concentración mínima
inhibitoria (CMI)

Es la medida de sensibilidad de una

bacteria a un antibiótico
Es la mínima cantidad de
antimicrobiano que es capaz de impedir
el crecimiento de un microorganismo
en condiciones normalizadas.
Concentración mínima de
antimicrobiano que inhibe el
crecimiento bacteriano
Caldo nutritivo
•Medio no selectivo, sus componentes constituyen la fuente de carbono y nitrógeno
necesarias para el adecuado desarrollo bacteriano. Potencial redox oxidado
 Componentes g/L

Agar nutritivo Pluripeptona 5

Extracto de carne 3

Cloruro de sodio 8

• Medio de cultivo nutritivo no selectivo. Agar 15

• Pluripeptona y el extracto de carne constituyen la
fuente de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes para el pH=7.3 0.2
desarrollo bacteriano.
• El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico
• Agar es el agente solidificante
• permite una clara visualización de las reacciones de
hemólisis.
MATERIAL
• Cajas Petri con agar nutritivo y cristal violeta a diluciones 1:10000(1 µg/mL); 100,000 (0.1 µg/mL);
1,000,000 (0,01 µg/mL)
• Cajas Petri con agar nutritivo y safranina a 1:10,00, 1:100,000 y 1:1,000,000.
• Cajas Petri con agar nutritivo.
• Solución de azul metileno al 2% en agua
• Solución de cristal violeta al 2% en agua.
• Solución de verde de malaquita al 2% en agua.
• Solución de verde de safranina al 2% en agua.
• Tubos de ensaye de 16 x150 mm con … de caldo nutritivo.
• Micropipetas automáticas de volumen variable (0-200 µl)
• Puntas estériles para micropipeta.
• Pipetas estériles de 1 mL
CEPAS
Escherichia coli Staphylococcus aureus

Gram (-) Gram (+)

Aerobio facultativo Anaerobio facultativo
No esporula No esporula

Bacillus megaterium
Klebsiella pneumoniae
Gram (+)
Gram (-)
Aerobio estricto
Anaerobio facultativo
Formadora de esporas
No esporula
 OBJETIVO
Realizar dos técnicas que permiten observar el
efecto de los colorantes sobre viabilidad de los
microorganismos
 I-. Efecto de los colorantes en tubo
Cepas:
Escherichia coli
1-. Colocar en una 2-. Hacer diluciones Staphylococus aureus
granilla una serie de decimales hasta a
11 tubos con 4.5 de partir del colorante
• Solución de azul metileno al 2% en agua
caldo nutritivo a estudiar
• Solución de cristal violeta al 2% en agua.
• Solución de verde de malaquita al 2% en
agua
3-. Inocular los
tubos con 100µl • Safranina.
4-. Incubar a 37° C
(una asada) del
por 24 hrs
microorganismo de
prueba.

6-. Resembrar una asada del

5-. Observar hasta
ultimo tubo la dilución mas alta
que tubo hay
en la que se observo inhibición
inhibición del
del crecimiento a un tubo de
crecimiento
caldo nutritivo.
 Safranina
Cristal violeta

Vede de malaquita Azul de metileno

Verde de malaquita Azul de metileno
Como calcular el CMI
2𝑔
2  % = 𝑚𝐿
100

  µg
  µg   /mL

Dividir entre diez por cada

dilución consecutivamente.
20,000/10=2,000
2,000/10=200
200/10=20……………
 Resultados
Cepa Diluciones CMI
Escherichia coli µg/ml

Colorante

Cristal
Cristal violeta
violeta al
al 2%
2% -- -- -- -- ++ ++ ++ ++ ++ ++ 0.2
0.2

Safranina
Safranina al
al 2%
2% ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ >2000
>2000

Azul
Azul de
de metileno
metileno al
al 2%
2% ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ >2000
>2000

Verde
Verde de
de malaquita
malaquita 2%
2% -- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 2000
2000

µg/ml
µg/ml 2,000
2,000 200
200 20
20 2
2 0.2
0.2 0.02
0.02 0.002
0.002 0.0002
0.0002 0.00002
0.00002 0.000002
0.000002

Crecimiento= +
No crecimiento= -
 Resultados
Cepa Diluciones CMI
Staphylococus aureus µg/ml

Colorante

Cristal violeta al 2% - - - + + + + + + + 20

Safranina 2% - - - + + + + + + + 20

Azul de metileno 2% - + + + + + + + + + 2000

Verde de malaquita 2% - - - + + + + + + + 20

µg/ml 2,000 200 20 2 0.2 0.02 0.002 0.0002 0.00002 0.000002

Crecimiento= +
No crecimiento= -
 Resultados
Colorante Escherichia coli Staphylococus aureus
Dilución CMI *Efecto Dilución CMI *Efecto
(µl/mL) (µl/mL)
Cristal violeta 10-5 0.2 Bactericida 20 Bactericida
Cristal violeta 10-5 0.2 Bactericida 20 Bactericida
Safranina - >2,000 Bactericida 20 Bactericida
Safranina - >2,000 Bactericida 20 Bactericida
Azul de metileno - >2,000 Bactericida 2000 Bactericida
Azul de metileno - >2,000 Bactericida 2000 Bactericida
Verde de malaquita 10-1 2000 Bactericida 20 Bactericida
Verde de malaquita 10-1 2000 Bactericida 20 Bactericida

*Bactericida o bacteriostático
Se desconoce la dilución= -
 II-. Efecto de los colorantes en placa
1-. Marcar en una placa
de gelosa simple, la de 2-. Sembrar en una
gelosa safranina y las asada de cada cultivo
tres de gelosa de cristal por estría abierta
violeta

Cepas
1. Escherichia coli
2. Staphylococus
aureus
3. Klebsiella 3-. Incubar a 37° C por 4-. Observar si hay
pneumoniae 24 hrs crecimiento
4. Bacillus
megaterium
Safranina
Dilución E.Coli B. Subtillis S. Aureus K. Pneumoniae Concentración
µg/ml

1:10 000 + - - + 1
1:100 000 + - + + 0.1
1:1000 000 + + + + 0.01
CMI µg/ml >1 0.1 1 >1

1:1000,000 1:100,000 1:10,000

Aplicaciones
Acridina
Se usa para el tratamiento de
quemaduras
Uso oftalmológico
Antisépticos
Uso histológico
Tratamiento contra parásitos
protozoo de agua dulce
 • La determinación del CMI nos ayuda a saber el
comportamiento de distintos microorganismos a
distintas concentraciones, en este caso colorantes
• Ventajas del método en tubo
Permite la resiembra para ver el efecto bactericida

Conclusione • Ventaja del método en placa

Nos permite observar 4 cepas a la ves
s • Desventaja del método en tubo
Es mas tardado
• Desventaja del método en placa
Se corre el riesgo que otros microorganismo
contaminen la muestra
 Referencias

• https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a28446b169d8.pdf
• http://saber.ucv.ve/bitstream/10872/19390/1/colorantes%20listo%20%2Bisbn.pdf
• https://es.slideshare.net/lauram9104/agentes-qumicos-16073956
• https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a28446b169d8.pdf
• http://www.telematica.ccadet.unam.mx/dentizta.ni/html/dental/pdfs/definiciones/colorante
s.pdf
• http://www.ugr.es/~pbaca/p3controlmecanicodebiopeliculasorales/02e60099f41037309/pra
c03.pdf