PRACTICA 8. MÉTODOS DE TINCIÓN.

Tinciones diferenciales: Gram y Ziehl-Neelsen.

Esta sesión es la continuación para la identificación de la muestra problema, misma que ya han elegido y
descrito macroscópicamente en la práctica 4. Uno de los métodos que aquí se realizarán permitirá comprobar
la pureza de la muestra problema además de clasificarla en base a su reacción a la tinción Gram.
OBJETIVO
El alumno identificará organismos de diferentes tipos en base al resultado de aplicar métodos de
tinción diferenciales.

FUNDAMENTO. La observación microscópica de las bacterias es más fácil cuando se tiñen. Sin
embargo, no es raro confundir un punto o bastón teñido sobre un fondo del mismo color con algún
artefacto. Este problema apareció cuando las muestras de tejidos infectados se teñían con azul de
metileno buscando a las bacterias incluidas.
El primer intento para resolver el problema fue decolorar los cortes después de la coloración.
En los tejidos que contenían bacilos tuberculosos, esto fue efectivo, pero en otros las bacterias se
decoloraban igual que los tejidos y no se ganaba nada. El problema fue resuelto por Hans Christian
Gram, patólogo danés que en 1884 introdujo un colorante de contraste después de la decoloración.
En esta tinción diferencial, las bacterias se teñían de púrpura oscuro con la llamada solución
de Ehrlich, violeta de genciana con anilina; y los tejidos circundantes con café de Bismarck o vesuvina.
Originalmente la coloración de Gram se desarrolló para visualizar a las bacterias en tejidos
animales, pero pronto se advirtió que era útil para la diferenciación de las mismas. Las bacterias que
son sometidas a este tratamiento se dividen en dos grupos: las que retienen el violeta de genciana o
cristal violeta, son denominadas Gram positivas; y las que se decoloran y se tiñen con el color de
contraste (generalmente rojo de safranina o fucsina básica), llamadas Gram negativas.
La afinidad tintorial se debe a numerosas diferencias en la estructura y composición química
de los componentes celulares, principalmente la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen
una pared compuesta principalmente de una capa de peptidoglicano relativamente gruesa (20nm - 80
nm). En cambio, las Gram negativas tienen una pared con una capa delgada de peptidoglicano (5nm
- 10 nm), además de una membrana externa constituida por fosfolípidos y lipopolisacárido.

Figura 1. Pared célula bacteriana. A. la pared de los Gram-negativos está compuesta por menor cantidad de péptidoglicano lípidos (membrana
externa) que la pared de los Gram-positivos B. (3)
 En general las bacterias Gram positivas son susceptibles a la penicilina y a varios agentes
químicos y son más resistentes a la desintegración por tratamientos mecánicos que las Gram
negativas. Las bacterias Gram negativas presentan susceptibilidad a antibióticos como la
estreptomicina. Las diferencias básicas en las estructuras superficiales de ambos grupos de bacterias
contribuyen a aclarar la diferencia en la respuesta a esta técnica de tinción. Durante la tinción, ambos
grupos se tiñen con el colorante primario (cristal violeta) y el mordente (yodo). El complejo colorante-
mordente es atrapado dentro de la célula Gram positiva por la deshidratación y la reducida porosidad
de su pared celular y no sale durante la etapa del lavado diferencial con etanol-acetona. Lo contrario
ocurre con las Gram negativas, dado que su delgada pared sí deja salir el colorante y de esta manera
toman con facilidad el colorante secundario o de contraste.

Figura 2. Tinción Gram. Después de la

aplicación del colorante primario (cristal
violeta), la decoloración, y la contratinción
con safranina, las células Gram-positivas
se tiñen de violeta y las células Gram-
negativas se tiñen de rosa/rojo. El cristal
violeta y la safranina son colorantes
básicos, el paso de decoloración es lo que
hace que la tinción de Gram sea diferencial.
(3)

La tinción de Ziehl-Neelsen es un tipo de coloración diferencial que fue desarrollado

inicialmente por Paul Erlich para poner de manifiesto la presencia de bacilos causantes de tuberculosis
en muestras clínicas de pacientes con esta enfermedad. El primero en usar un método de tinción para
este tipo de muestras fue Robert Koch, pero sus preparaciones llevaban mucho tiempo y no siempre
obtenía buenos resultados. Ehrlich modificó ese procedimiento, logrando preparaciones de menor
tiempo, pero todavía con algunos problemas en la calidad de las mismas. La técnica de Ziehl-Neelsen,
usada actualmente, es una ligera modificación de la original usada por Ehrlich. Esta técnica aprovecha
las cualidades peculiares de las bacterias de los géneros Mycobacterium y Nocardia, las cuales son
decoloradas por soluciones de alcohol ácido, pero que se pueden teñir con muy diversos colorantes
si estos se aplican en soluciones alcalinas con una pequeña cantidad de fenol y calentando
suavemente por unos pocos minutos. Estos géneros bacterianos presentan en su estructura un
elevado contenido de ácidos grasos de cadena muy larga constituidos en ceras y ácidos micólicos y
nocárdicos respectivamente. Estas ceras parecen jugar un papel muy importante en la respuesta
bacteriana a la coloración.
Se ha postulado que el elevado contenido de ácidos grasos interviene decisivamente en la
coloración, ya que, al calentar la preparación con el colorante primario hasta emisión de vapores, se
favorece la fusión de las ceras y se aumenta la energía cinética de las moléculas, fenómenos que
facilitan la entrada del colorante a la célula. Al suspender el calentamiento y lavar con agua fría, se
provoca la solidificación de las ceras, de modo que el colorante ya no puede salir. También se ha
postulado que la mezcla del colorante con fenol tiene una mayor solubilidad en los lípidos bacterianos
que en el agente decolorante, lo cual contribuye a su permanencia en el interior de las células. Puesto
que el proceso de decoloración es muy enérgico, cualquier bacteria que no contenga abundantes
lípidos como los de Mycobaterium y Nocardia, perderá el colorante primario durante la decoloración y
tomará el colorante de contraste.

Figura 3. Tinción de ZIEHL-

NEELSEN. Las células
ácido-resistentes se tiñen
color púrpura rojizo; las no
ácido-resistentes se tiñen
de azul o del color de la
contratinción si se utiliza
una diferente. (3)

Las bacterias que resisten la decoloración por alcohol ácido se denominan bacilos ácido-alcohol
resistentes (BAAR). En la actualidad, la tinción Ziehl-Neelsen tiene una gran importancia como
prueba de diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis.

DESARROLLO

MATERIAL

Para la tinción de Gram.

• Solución de cristal violeta;
• Solución de lugol;
• Solución de alcohol acetona;
• Solución de safranina;
• Portaobjetos;
• Microscopio;
• Asa;
• Puentes de coloración;
• Cepas problema: Cultivos de 24h y 96h. Cultivo de muestra problema de 24h de incubación.

Para la tinción de Ziehl-Neelsen.

• Solución de fucsina fenicada;
• Solución de alcohol ácido;
• Solución de azul de metileno;
• Puentes de coloración;
• Portaobjetos;
• Microscopio;
• Asa;
• Cepas problema;
MÉTODOS

Tinción de Gram (A)

1. Haga un frotis de cada bacteria (incluya la muestra de su interés) y fíjelos con calor.
2. Cubra los frotis con cristal violeta y déjelo actuar durante 1 min. Escurra el colorante y
lave con chorro suave de agua.
3. Cubra los frotis con solución de lugol y déjelo actuar durante 1 min. Escurra el reactivo y
lave con chorro suave de agua.
4. Coloque el frotis en forma vertical y, usando un fondo blanco, decolore añadiendo gota a
gota la solución de alcohol-acetona durante 5 seg a 15 seg. El momento exacto para
terminar la decoloración es cuando dejan de fluir “hilos de colorante” por el frotis. Este es
el paso crítico de la tinción. Lave inmediatamente con un chorro suave de agua.
5. Cubra el frotis con safranina y déjela actuar durante 1 min. Escurra el colorante y lave con
un chorro suave de agua. Deje secar al aire.
6. Observe sus preparaciones al microscopio con objetivo de inmersión.
7. Repita el procedimiento con una colonia de actinomicetos aislados de la práctica 3. Debido
a que las colonias de actinomicetos son duras, no se disgregan fácilmente y son difíciles
de extender; para hacer el frotis, debe extraer la colonia del agar y colocarla entre dos
portaobjetos para comprimirla hasta disgregar el micelio. Antes de fijarla, conviene retirar
del portaobjetos los fragmentos grandes de agar o restos celulares.
8. Interprete como sigue: Células color morado: Gram (+), Células color rojo/rosa: Gram (-).

Figura 5. Tinción Gram de Staphylococcus (+) y Proteus (-).

Staphylococcus tiene una disposición estafilocócica, mientras
que Proteus es un bacilo. (3)
Figura 4. Metodología para Tinción Gram (2)

Influencia de la edad de los cultivos sobre la tinción de Gram (B). Figura 6.

1. De cada uno de los cultivos viejos de bacterias (96 h), haga frotis y fíjelos al calor.
2. Tiña los frotis por la técnica de Gram.
3. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión.

Técnica de Gram por pasos (C)

1. Haga cuatro frotis con una mezcla de bacterias y fíjelos al calor.
2. Inicie la tinción de Gram y separe un frotis después de cada uno de los pasos de la técnica.
3. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
Tinción Gram de un cultivo de 24 h de Tinción Gram de un cultivo de 48 h de Tinción Gram de un cultivo de 72 h de
Escherichia coli. Muestra resultados uniformes. Escherichia coli. La mayoría de las células son Escherichia coli. Solamente unas pocas células
Todas las células son rojas, una reacción Gram rojas, una reacción Gram negativa, pero algunas son rojas, y la mayoría de las células se tiñeron
negativa. células se tiñeron ligeramente. ligeramente.

Tinción Gram de un cultivo de 24 h de Tinción Gram de un cultivo de 48 h de Tinción Gram de un cultivo de 72 h de

Staphylococcus aureus muestra resultados Staphylococcus aureus. No muestra resultados Staphylococcus aureus. Los cultivos más viejos
uniformes. todas las células son moradas, una uniformes. Aunque la mayoría de las células son rinden resultados altamente variables, muchas
reacción Gram positiva. moradas, una reacción Gram positiva, algunas células muestran una reacción Gram positiva y
células son rojas, una reacción Gram negativa. muchas una reacción Gram negativa.
Figura 6. Influencia de la edad de los cultivos sobre la tinción de Gram.
(1)
Influencia del tiempo de decoloración en la técnica de Gram (D)
1. Haga dos frotis con una mezcla de bacterias.
2. Tiña los frotis con la técnica de Gram dejando actuar la solución de alcohol-acetona tres
segundos en uno y tres minutos en el otro.
3. Observe al microscopio con objetivo de inmersión.

Tinción de Ziehl-Neelsen (E)

1. Haga un frotis con cada una de las cepas proporcionadas.
2. Deje secar al aire y fije por calor.
3. Cubra el portaobjetos con fucsina fenicada.
4. Caliente suavemente con el mechero hasta la emisión de vapores. El colorante no debe
secarse ni hervir, añada más si es necesario. Mantenga la emisión de vapores por 5 min.
5. Lave con chorro suave de agua.
6. Decolore exhaustivamente con alcohol ácido.
7. Lave con chorro suave de agua.
 8. Cubra el frotis con azul de metileno durante 1 min
9. Lave con chorro suave de agua, escurra y deje secar al aire.
10. Tiña una de las colonias de actinomicetos con esta técnica siguiendo las
recomendaciones para la preparación del frotis que se proporcionaron para la tinción de
Gram.
11. Observe al microscopio con objetivo de inmersión.
12. Interprete como sigue: Células color azul: BAAR (-), Células color rojas: BAAR (+).

Figura 8. Tinción Zielh Neelsen. Bacilos: Mycobacterium phlei (BAAR

Figura 7. Metodología para Tinción Zielh Neelsen (Bacilos Ácido Alcohol +) y cocos agrupados en racimos: Staphylococcus epidermidis
Resistentes). (2) (BAAR -). (3)

Con los métodos realizados se resalta la importancia del uso de cultivos bacterianos frescos en la
realización de las pruebas de identificación de un microorganismo para evitar resultados confusos y
erróneos. Ahora, compare lo observado microscópicamente en el frotis de la muestra problema con
las muestras conocidas para determinar lo siguiente:

1. La pureza de la muestra problema; si observa una coloración y morfología microscópica

uniforme.
2. La morfología y agrupación
microscópica de la muestra problema.
La morfología de las células pueden
ser esferas (cocos), bastones (bacilos)
o espirales (spirilla). Las variaciones
de estas formas incluyen bacilos
ligeramente curvados (vibrios), bacilos
cortos (cocobacilos) y espirales
flexibles (espiroquetas). Los espirilos
generalmente se muestran como
células individuales; los cocos y los
bacilos forman asociaciones
mutlicelulares, las cuales pueden ser:
diplococo o diplobacilo, estreptococo o
estreptobacilo. Otros arreglos
exclusivo de los cocos: tétradas, Figura 9. Agrupaciones microscópicas de los cocos. (3)
sarcina, estafilococo. (Leboffe, 2010).
3. La clasificación del microorganismo de acuerdo con la reacción de Gram: Células color
morado: Gram (+), Células color rojo/rosa: Gram (-).
RESULTADOS

1. En una tabla proporcione la morfología microscópica y la reacción de Gram de cada cepa

probada. Indique para las colonias de actinomicetos la presencia o no de micelio
microsifonado, de esporas y el tipo de esporas.
Cepa probada Reacción a tinción Gram

2. Haga esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el punto A.

Gram(+) Gram(-) Cepa aislada Actinomiceto

3. Haga esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el punto B.

Cultivo viejo gram (+) Cultivo viejo gram (-)

4. Haga esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el punto C.

Cristal Violeta Lugol Alcohol-Acetona Safranina

 5. Haga esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el punto D.

3 seg 3 min

6. En una tabla proporcione la morfología microscópica y la reacción a la tinción de Ziehl-Neelsen

de cada uno de los frotis preparados, tanto de las cepas proporcionadas como de una de las
colonias de actinomicetos.

Cepa probada Reacción a tinción Ziehl Neelsen

7. Haga esquemas a colores de las preparaciones observadas den el punto E.

BAAR (+) BAAR (-) Actinomiceto

CUESTIONARIO

Investiga las respuestas para las preguntas siguientes y con ellas redacta un párrafo a manera
de discusión. No olvides escribir la bibliografía consultada.

1. ¿Qué importancia tiene la técnica de tinción de Gram en la identificación de las bacterias?

2. Mencione la importancia de la técnica de Ziehl-Neelsen en la identificación de las bacterias.
3. ¿Cuál es el paso crítico en la técnica de coloración de Gram? diga por qué.
4. Mencione el nombre de tres bacterias (género y especie) Gram positivas y Gram negativas,
diferentes a las que trabajo durante el desarrollo de la práctica.
OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

BIBLIOGRAFIA
1. Alexander S. K. & Strete D. (2001). Microbiology: a photographic atlas for the laboratory. United
States of America: Benjamin Cummings
2. Benson H. (2002). Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology.
Boston Mass: McGraw-Hill.
3. Leboffe M. J. & Pierce B. E. (2010). Microbiology Laboratory Theory & Application. United
States of America: Morton Publishing Company.
4. Reyna L. G. (2008). Manual de Prácticas. Laboratorio de Bacteriología y Micología Generales.
México: Universidad de Guanajuato