PRACTICA No.

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COLORACIONES
OBJETIVOS
 Conocer el fundamento de la coloración de Gram
 Realizar correctamente la coloración de Gram.
 Clasificar las bacterias por su afinidad tintorial, su morfología y agrupación.
 Conocer el fundamento de la coloración de Ziehl-Neelsen
 Identificar los bacilos ácido-alcohol resistentes al microscopio

MARCO TEORICO

COLORACIÓN DE GRAM
La coloración de Gram es una de las más importantes en la microbiología. Fue
desarrollada por el danés Hans Christian Gram en 1884, utilizaba en el laboratorio para
diferenciar entre las bacterias basándose en las propiedades fisiológicas de la pared
celular. La propiedad de la Gram positividad depende de la naturaleza y composición
química de la pared bacteriana, por ello las bacterias Gram positivas pierden esta
capacidad cuando sufren pérdida total o parcial de su pared. El tratamiento de las células
primero con cristal violeta y luego con lugol lleva a la formación de un gran complejo
insoluble. El complejo es retenido por la gruesa capa que forma el peptidoglucano en las
bacterias Gram-positivas; en las bacterias Gram-- negativas este complejo es extraído por
un solvente alcohólico. Es posible obtener “Gram-negativos falsos” si la bacteria Gram-
positiva es vieja, dañada o si la pared celular no está intacta. No hay un equivalente
“Gram-positivo falso” pero un Gram-positivo falso puede ocurrir si el paso de decoloración
es omitido accidentalmente

LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LOS CULTIVOS

Para la lectura, interpretación e identificación del crecimiento bacteriano, primero que todo
se sigue un estudio cualitativo que comprende los siguientes parámetros:

1. Características Microscópicas de la Colonia

Las características microscópicas de las colonias se estudian mediante la coloración

de Gram que permite clasificar las bacterias en 2 grandes grupos: Gram- Positivas y
Gram-Negativas. Además de la afinidad, esta coloración permite establecer la
morfología (cocos, bacilos, espirilos, cocobacilos, vibrios, etc.) la agrupación (en pares,
cadenas, tétradas, racimo, sarcina, empalizada, caracteres, etc.) y a veces la cápsula.
Para observar otras estructuras, se emplean coloraciones específicas. Tabla No.1
a. Morfología
b. Agrupación
c. Afinidad

La coloración de Gram permite establecer un diagnóstico presuntivo del agente infeccioso

basado en los siguientes aspectos:

a. La morfología observada puede ser:

a. Cilíndrica: Bacilos.
b. Esférica: Cocos
c. EspiriIada: Espirilos
b. La afinidad tintorial observada puede ser:
 Gram positivos
 Gram negativos

c. La agrupación celular puede ser:

 Diplococos
 Racimos
 Cadenas
 Tétradas

Tabla No. 1 Procedimiento Coloración de Gram

PASOS REACTIVO GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS

Colorante básico Cristal violeta Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta

Fijador Lugol Permanece violeta Permanece violeta

Etanol 95% o
Decolorante alcohol-acetona Permanece violeta Se decolora

Colorante de Safranina Permanece violeta Se tiñe de rosado

contraste

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN

Las micobacterias son bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR), que se encuentran

ampliamente distribuidos en la naturaleza teniendo en cuenta que los de mayor
importancia clínica para el hombre son: Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Complejo
avium-intracellulare, entre otras. El M. tuberculosis es un bacilo delgado no formador de
espora, su pared se encuentra constituida principalmente de lípidos, los cuales le
confieren la ácido resistencia.
El mecanismo de la ácido alcohol resistencia, es doble y requiere la penetración de la
fucsina al citoplasma bacilar, así como la interacción química con los ácidos micólicos y
los péptidos, glicolípidos presentes en la pared celular de la micobacterias. Esta reacción
impide la salida de la fucsina atrapada en el citoplasma celular, cuando es expuesta a la
acción resistente del alcohol ácido, lo cual permite la coloración rojo intenso de los
bacilos. El papel del mordiente (solución fenolada), es definitivo porque fomenta la
penetración de la fucsina y su unión con los lípidos bacilares, haciéndola más liposoluble
y menos hidrosoluble.

La coloración se realiza en tres tiempos:

Tinción, decoloración y contraste.

PROCEDIMIENTO

COLORACION ZIEHL-NEELSEN :
1. Colocar las láminas fijadas sobre soportes con el extendido hacia arriba separadas y
con un número de identificación orientado hacia el operador.
2. Cubra la totalidad del extendido con fucsina de Ziehl-Neelsen.
3. Caliente suavemente con la llama de un mechero, pasándola por debajo de las láminas
hasta que se produzca emisión de vapores, evitando que hierva.
4. Dejar la emisión de vapores por un periodo de 10 minutos.
5. Si ocurre evaporación del colorante agregar más colorante.
6. Dejar enfriar y lavar suavemente con agua de chorro.

DECOLORACION:
1. Cubrir el extendido teñido con alcohol ácido al 3% durante 1 minuto y lave suavemente
con agua de chorro.
2. Si el extendido conserva el color rojo o Rosado, volver a decolorar y lavar nuevamente.

CONTRASTE:
1. Cubrir el extendido decolorado con azul de metileno por 2 minutos.
2. Lavar suavemente con agua de chorro.
3. Limpiar la parte posterior del extendido para retirar residuos de colorante que puedan
interferir con la lectura.
4. Deje secar a temperatura ambiente en posición vertical.

Nota: Cada vez que se haga la coloración se debe realizar un control positivo y uno
negativo.

LECTURA Ziehl-Neelsen:

Lectura Microscópica:
1. Tomar la lámina asignada por su profesor-
a. Se debe enfocar la lámina con el objetivo de inmersión con la ayuda del aceite de
inmersión.
b. La lámina se observara de izquierda a derecha por el centro hasta el extremo,
baje o suba y regrese de derecha a izquierda.
c. Registrar el número de bacilos por campo microscópico observado.
d. Al observar al microscopio los bacilos se ven de color rojo con un fondo de color
azul.

COLORACION DE GRAM:
1. Realice la coloración a partir de los cultivos realizados en la clase.
a. Marcar la lámina portaobjetos con el número del cultivo.
b. Colocar una pequeña gota de solución salina estéril sobre la lámina.
c. Tomar el asa y esterilizar en la llama del mechero.
d. Tocar con el asa estéril y fría una colonia del cultivo.
e. Emulsionar sobre la solución salina y extender en forma circular en un diámetro de
20mm.
f. Dejar secar a temperatura ambiente.
g. Fijar la preparación pasándola de 3 a 5 veces sobre la llama del mechero.
h. Realizar la coloración de Gram.
i. Dejar secar a temperatura ambiente.
j. Observar al microscopio con objetivo de 100 x.

PROCEDIMIENTO:
1. Cristal Violeta 1min
2. Lavar con agua
3. Lugol 1 min
4. Lavar con agua
5. Alcohol acetona 10 seg
6. Safranina 30 seg
7. Lavar con agua

COLORACION PARA ESPORAS

Algunos géneros bacterianos desarrollan unas estructuras conocidas como endosporas ,

son formas bacterianas producidas cuando las condiciones ambientales son
desfavorables. Las endosporas poseen una cubierta que las hace muy resistentes a los
factores externos debido a esto son difíciles de teñir, pero si se calienta la preparación se
permeabiliza un poco permiriendo la entrada del colorante. Todas las especies de los
géneros Bacillus y Clostridium producen endosporas. La coloración de Schaeffer-Fulton
emplea verde de malaquita como colorante primario que al calentarse permite la
penetración a la endospora, esta coloración utiliza la safranina como colorante de
contraste.

Procedimiento

1. Realizar el frotis de la misma manera que para hacer una lámina para la coloración
de Gram
2. Agregar la solución de verde de Malquita al 5 %, cubriendo todas las bacterias
del portaobjetos.
3. Celentar la muestra durante 3 minutos, evitando que se seque
el colorante
4. Lavar con agua corriente
5. Aplicar el colorante de contraste la safranina durante 30 segundos
aproximadamente.
6. Lavar con agua corriente
7. Observar al microscopio

EJERCICIO

1. De los componentes de la coloración de Gram nombre la función de:

Cristal violeta
Lugol
Alcohol acetona
Fushina
2. Dibuje como se observa al microscopio un microorganismo Gram positivo y uno
Gram negativo ( Dibuje lo que observo en su práctica)

3. Que estructura de la pared bacteriana es la responsable de la acido alcohol

resistencia

4. Investigue un género bacteriano que desarrolle endosporas diferente a los

mencionados en su guía y su importancia clínica