PCR

Keny Davi Alvarado Quiroz

 Sensibilidad
Específica
• Rápido
Gran n° de Copias • Económico

Primers • Delimitan longitud

Ciclos Repetitivos • 3 Temperaturas

CARACTERÍSTICAS DE
AMPLIFICACIÓN
Dirección
Mismas reglas de la Replicación
5’ – 3’

ADN molde Complementariedad Cadena Paralela

REQUERIMI
ENTOS DE
LA PCR
 Taq Polimerasa mas
usada

Polimeriza DNA molde

Otra cadena

Termo resistente

Concentración 1 a 2.5u
1000nt x min

Cantidad suficiente 25 –
40 ciclos
DNA POLIMERASA

Baja concentración
ADN
Fidelidad de la
amplificación del

Alta concentración
productos
inespecíficos
Amplificación de
 DNA MOLDE
Teóricamente 1 moléculas de DNA
Extracción de Ac. cDNA 25 a
RNA DNA 300ng Optimizar
Nucleótidos 100ng

Diluciones del
Calidad Adecuada Paso Previo Ciclos iniciales 1/10,1/25, 1/50,
1/100 y 1/200

Retrotranscripción dsDNA
DESOXINUCLEÓTIDOS
TRIFOSFATO (dNTPs)
dATP,
dCTP,
Concentración Optima >200ug <50ug
dGTP,
dTTP,

Genera 6.5 a 25 ug Incorporaciones

50 – 200uM Insuficientes
DNA erróneas
BUFFER
pH, concentración de Sales

pH 8,4

Tris HCl y KCl

 ION MAGNESIO – CLORURO
DE MAGNESIO

Cofactor esencial
Optimizada
de DNA Concentración Exceso Baja
experimental
polimerasa

Amplificación Disminución
1 – 2.5 mM
Inespecífica producto
INICIADORES/PRIMERS
Concentración
0.3 – 1uM

Exceso
Productos no específicos

Baja

Terminen los iniciadores antes finalizar los ciclos de la PCR

 INICIADORES

Evitar más de tres

extremo 3’ las últimas
18-30 pb. GC 60%/40%. repeticiones
bases sean G o C.
consecutivas

Temperatura de fusión Exonico

Se debe evitar la (Tm), se calcula con • RNA
complementariedad base en la siguiente 100 a 1000pb – 200 a
entre la pareja de fórmula: 500 pb
iniciadores • Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
 ADITIVOS

DMSO Glicerol Detergentes no BSA Betaina

• Disminuye la • Incrementa la iónicos • Amplificar ADN • Mejora la
estructura secundaria estabilidad térmica • Estabilizan a la Taq antiguo o muestras amplificación de los
del ADN de la enzima polimerasa e inhiben de ADN con fragmentos
inhibidores de PCR
la formación
como la melanina
Comerciales
estructuras
secundarias
 Des
n at u
rali
z ac
ión

Cic
Des Am lo de
nat plif
ura icac
liza ión
ció
n

Ali
nea
ció
n

Elo
n gac
ió n
ESQUEMA DE LA PCR

Am
p lific
ació
nF
ina
l

Alm
a c en
am
ien
to
DESNATURALIZACIÓN
Calentamiento

94 y 96 °C

Romper los puentes de hidrógeno

Cadena queda como molde

ALINEACIÓN

Alinean los iniciadores a sitios específicos complementarios

Baja la temperatura entre 40 y 60 °C

Unión (alineamiento) de los iniciadores.

ELONGACIÓN

Sintetiza una nueva cadena en sentido 5’ a 3’

Temperatura, por lo general a 72 °C, Temperatura óptima

La polimerasa se une a los iniciadores y comienza la ADN replicación.

CANTIDAD DEL PRODUCTO
SENSIBILID
AD DE LA
TÉCNICA
100?
 ANTES DE EMPEZAR
Esterilizar el material

Etiquetar todo el material

Determinar las condiciones de la PCR

Limpiar el área de trabajo

Descongelar todos los reactivos en baño de hielo y mezclarlos perfectamente.

Únicamente la enzima se mantiene en el congelador

Programar el termociclador.
DESNATURALIZACIÓN
INICIAL
Entre 94 y 96
°C durante 5-10
Se determinan minutos.
de acuerdo a
ADN y de la
ADN
polimerasa
CICLOS DE LA PCR

25 y 35 veces
DESNATURALIZACIÓN

Alto contenido de
guaninas y citosinas
se recomienda
94 ºC durante 30 aumentar el tiempo o
segundos a 1 minuto la temperatura.
ALINEAMIENTO

Alineamiento oscila entre 45 y 65 ºC durante

un tiempo entre 30 segundos y 1 minuto
EXTENSIÓN
30 segundos a 1
minuto
Tiempo de extensión
depende de la
longitud del
Realiza a 72ºC fragmento a
porque es la amplificar
temperatura a la cual
la Taq polimerasa
alcanza su mayor
actividad.
EXTENSIÓN FINAL

Sintetizar todos los

fragmentos que
pueden haber
Al terminar los quedado
ciclos, se realiza una incompletos.
última extensión de
aproximadamente 5
minutos a 72 ºC
RECOMENDACIONES
Control Negativo, Control Positivo
Materiales consumibles, nuevos y estériles
Pipetas y Áreas exclusivas para PCR
Hacer Alícuotas de todos los reactivos
Concentraciones sean las que se establecieron
No más de 40 ciclos porque los productos inespecíficos
Fase estacionaria, la cantidad de sintetizado es suficiente
APLICACIONES
Biotecnología
Ecología
Evolución
Biología de la conservación
Arqueología,
Patología
Medicina forense
VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Ventaja
• Generar millones de
copias Desventaja
• Estandarizar la técnica
ACTIVIDADES
COMPLETE LOS CUADROS CON LOS
COMPONENTES QUE SE NECESITAN
PARA UNA PCR EXITOSA. DE FALTAR
ALGÚN COMPONENTE AÑÁDALO
A CONTINUACIÓN SE PRESENTAN
CUADROS CON LAS ETAPAS DE LA PCR,
INDIQUE LOS
NOMBRES DE CADA ETAPA Y REDACTE
LOS SUCESOS QUE OCURREN EN CADA
FASE DE ESTA TÉCNICA IN VITRO.
OBSERVE LA GRÁFICA DE
AMPLIFICACIÓN DE
PRODUCTO DE UNA PCR Y
COMENTE
EN LOS SIGUIENTES GRÁFICAS, INDIQUE LOS PASOS DEL
PROTOCOLO DE PCR Y DIGA SI
HUBIESE ALGÚN ERROR EN ESTE PROTOCOLO, CORRIJA LOS
ERRORES DE SER ENCONTRADOS.