SÍNTESIS DE

cDNA
Keny Davi Alvarado Quiroz
 RNA polimerasa
AR Sintetiza
N
Dirección 5’ – 3’
Transcripción

3’ – 5’
Molde
Antisense
No codificante
 • Misma secuencia
• T, no U
• Sense
ADN
complementario • Codificante
TRANSCRIPCIÓN INVERSA
PCR
Molde Inicial

ARN
ADNc

Retrotranscripción o Transcripción Inversa

 Extracción RNA
Fabricar cDNA PCR

Transcriptasa Inversa
Retrovirus

OligodT – Cebador
Solo mRNA 3’ – 5’

cDNA no Cadena Complementaria

TAQ polimerasa PCR

 Calidad no Poca
alta Abundancia

Región unión No 2 primers

2 primers PCR = Perdida
CEBADORES

Oligonucleótidos
Random Primers Específicos

OligodT
OLIGONUCLE  Evita casi
siempre
ÓTIDOS  No molde otros
ESPECÍFICOS mRNA
OLIGOdT
Ventajas
• Solo cDNA – RNA poli A
• Evita amplificaciones Inespecíficas

Desventajas
• cDNA menos completos
• Región 5’
• Progresa hasta el final
RANDOM PRIMERS
Síntesis Representativos

Purificar RNAm

• Cromatografía Afinidad poliT

No purificación – Poco cDNA

• mRNA porción RNA total

REACTIVO
Primers Oligo ADN polimerasa Mg+2
(dT) dependiente de DTT
• 12 – 18 ARN • Favorece
deoxitimidinas Transcriptasa
Primers

Transcriptasa Inversa

Deoxinucleótidos

Buffer de Reacción
Primers Inversa
Random Inhibidores
• 6 nucleótidos RNAsas
• Cualquier ARN
Primers
Especificos
• RT – PCR
AMPLIFICACIÓN cDNA POR
PCR

Desnaturalización Unión (Anneling) Síntesis

cDNA
DETECCIÓ
N DE LA
SEÑAL
Electroforesis en gel de
Agarosa
COMPROBACIÓN
ESPECIFICIDAD
Comparar migración DNA estándar (Gel)

Oligonucleótidos Complementario (sonda)

Fragmento Restricción

Secuencia de Fragmentos Esperada

  Gran Sensibilidad
RT PCR  mRNA especifico
 (<0.1 ng de RNA total)
CRITERIOS SELECCIÓN
PRIMERS
Contaminación DNA mRNA Evitar coamplificación
genómico (Desconocemos • Primers ambos lados del
• 2 primers exones Estructura) Stop
diferentes • Primers Separados 300 a
400 pb

Información parcial No información cDNA No intrones

del cDNA • Primers otra especie • DNAsas
• 1 primer • Disminuyen RNA - RT
• 2 – OligodT
COMPARACIÓN DE DOS KITS DE RT-PCR EN
LA DETECCIÓN DE ARNM DE DOS GENES
ENDÓGENOS DE PAPA