TEMA 6B.

TÉCNICAS DE GENÉTICA Y GENÓMICA

BACTERIANA

6.1 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

6.1.1 Tipos de cortes de las enzimas de restricción
6.1.2 Modificación: protección de las restricción
6.1.3 Análisis del ADN mediante enzimas de restricción

6.2 AMPLIFICACIÓN DEL ADN: LA REACCIÓN EN CADENA

DE LA POLIMERASA (PCR)

6.3 CLONACIÓN MOLECULAR

6.3.1 Conceptos
6.3.2 Los Plásmidos como vectores de clonación
6.3.3 El bacteriófago lambda como vector de clonación

6.4 MUTAGÉNESIS IN VITRO Y DIRIGIDA

6.4.1 Mutagénesis dirigida
6.4.2 Mutagénesis con casete e interrupción génica
TEMA 6B. TÉCNICAS DE GENÉTICA Y GENÓMICA

6.5 TÉCNICAS DE CLONACIÓN GENÓMICA

6.5.1 Vectores para la clonación genómica y secuenciación
6.5.2 Clonación y mapas genómicos

6.6 GENOMAS MICROBIANOS

6.6.1 Genomas procarióticos
6.6.2 Genomas de microorganismos eucarióticos
6.6.3 Genomas de orgánelos
6.6.2 Evolución y familias genéticas

6.7 FUNCIÓN GENÉTICA Y REGULACIÓN

6.7.1 Proteómica
6.7.2 Micromatrices (microarreglos)
6.7.3 Metagenómica
ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: ENZIMAS PRESENTES EN
PROCARIOTAS (BACTERIAS Y ARCHAEA) Y ALGUNOS VIRUS
EUCARIOTAS, CUYA FUNCIÓN ES PROTEGER LAS CÉLULAS DE ADN
EXTRAÑO, RECONOCIENDO SUS SECUENCIAS Y CORTÁNDOLO.
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DEL TIPO II, RECONOCEN
SECUENCIAS ESPECÍFICAS, Y CORTAN EL ADN DENTRO DE ESTA
SECUENCIA.

ASUMIENDO SIMILAR PROBABILIDAD
PARA CADA PAR DE BASE EN EL ADN
Sitios de 4 pb  1/ cada 256 pb
Sitios de 6 pb  1/ cada 4096 pb
Sitios de 8 pb  1/ cada Mega pb
MODIFICACIÓN: UNA PARTE INTEGRAL DE
LOS SISTEMAS DE RESTRICCIÓN
MODIFICACIÓN, ES LA ENZIMA
MODIFICANTE, LA CUAL MODIFICA LA
SECUENCIA ESPECÍFICA EN SU PROPIO
ADN, DE MANERA QUE NO SEAN
ATACADAS POR LAS PROPIAS ENZIMAS
DE RESTRICCIÓN DE LA CÉLULA. ASÍ
CADA ENZIMA DE RESTRICCIÓN TIENE
SU CORRESPONDIENTE ENZIMA
MODIFICADORA DE LA SECUENCIA DE
RESTRICCIÓN (EcoRI  EcoRI metilasa)
A) LAS ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN TIPO II EXHIBEN
SIMETRÍA BINARIA ALREDEDOR
DE UN PUNTO DADO.
TAL ESTRUCTURA SE DENOMINA
PALÍNDROME (SECUENCIA DE
CARACTERES QUE DICE LO
MISMO CUANDO SE LEE DE
DERECHA A IZQUIERDA Y
VICEVERSA).
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
QUE RECONOCEN SECUENCIAS
PALINDRÓMICAS GENERAN
FRAGMENTOS TERMINALES
COHESIVOS
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
QUE RECONOCEN SECUENCIAS
NO PALINDRÓMICAS CORTAN
CERCA DE LA SECUENCIA PERO
NO DENTRO DE ESTAS. ESTAS
ENZIMAS GENERAN
FRAGMENTOS TIPO ROMO.
ANÁLISIS DE ADN MEDIANTE
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

1) ELECTROFORESIS EN GEL

2) MAPA FÍSICO

3) HIDRIDACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLÉICOS
- SOUTHERN BLOT (ADN)
- NORTHERN BLOT (ARN)
AMPLIFICACIÓN
DEL ADN
 LA REACCIÓN EN
CADENA DE LA
POLIMERASA
1) EL ADN SE CALIENTA PARA SEPARAR LAS
CADENAS Y, JUNTO A LA ADN
POLIMERASA, SE AÑADE EXCESO DE
CEBADORES COMPLEMENTARIOS TANTO A
LA CADENA DIANA COMO LA
COMPLEMENTARIA
2) HIDRIDADOS LOS CEBADORES, LA
EXTESIÓN DE ESTOS PROPORCIONA UN
SEGUNDO ADN BICATENARIO
3) UN POSTERIOR CALENTAMIENTO,
HIBRIDACIÓN Y EXTENSIÓN DEL
CABADOR, PORDUCE UUN SEGUNDO ADN
BICATENARIO
4) EL NÚMERO DE COPIA DE LA SECUENCIA,
INCREMENTA EXPONENCIALMENTE CON
EL NÚMERO DE CICLOS
 UTILIDAD DE LA REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA
1) OBTENCIÓN DE ADN PARA CLONACIÓN
O SECUENCIACIÓN
2) ESTUDIOS COMPARATIVOS O
EVOLUTIVOS
3) ANTROPOLOGIA MOLECULAR
4) DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
(IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS PATÓGENOS Y
AMBIENTALES)
5) HUELLAS DE ADN EN LAS CIENCIAS
FORENSES
CLONACIÓN
MOLECULAR
CLONACIÓN MOLECULAR ETAPAS DE LA
(CLONACIÓN GÉNICA) CLONACIÓN MOLECULAR

1) Aislamiento y fragmentación
ES EL PROCESO del ADN de partida
MEDIANTE EL CUAL SE
PUEDEN AISLAR 2) Unión de los fragmentos
GRANDES CANTIDADES de ADN a pequeños
elementos genéticos usados
DE GENES ESPECÍFICOS
para replicar genes,
O FRAGMENTOS
conocidos como vector de
CROMOSÓMICOS EN
clonación, usando la enzima
FORMA PURA; Y ADN ligasa
CONSTITUYE LA BASE DE
LA MAYORÍA DE LOS 3) Introducción y
PROCEDIMIENTOS DE mantenimiento en un
INGENIERÍA GENÈTICA organismo hospedero para
crear la genoteca o librería
de genes
 1) Es relativamente pequeño (4361 pb)
2) Se mantiene de forma estable en el
CARACTERÍSTICAS DEL hospedero en un número de copias
PLÁSMIDO PBR322 relativamente alta, 20-30 copias por
células
3) Puede ser amplificado hasta un
número entre 1000-3000 copias por
células (40 % del genoma) por
inhibición de la síntesis de proteína
mediante adición de Cloranfenicol.
4) Es fácil de aislar en la forma
superenrollada usando diversas técnicas
5) Se puede insertar en el una cantidad
razonable de ADN foráneo (hasta 10 kb)
6) Se conoce la secuencia completa de bases
de este plásmido, lo que permite localizar
sitios en los que pueden actuar las
enzimas de restricción
7) Existen sitios únicos de cortes para
varias enzimas de restricción (PstI, SalI,
EcoRI, HindIII, BamH1) lo que permite
linealizar el plásmido sin perdida de
fragmentos
8) Tiene dos marcadores de resistencia a
antibióticos (Amp, Tet)
9) Se introduce fácilmente a la célula por
transformación
VENTAJAS DE LOS VECTORES DE NUEVA GENERACIÓN
- Contienen sitios de clonación múltiples (polylinker)
en un marcador genético
- Es fácil de seguir la inactivación insercional del gen
marcador, la cual en algunos casos puede utilizarse
como selección positiva
EL BACTERIÓFAGO
LAMBDA COMO
VECTOR DE
CLONACIÓN
VECTOR DE NUEVA GENERACIÓN USADO EN EL LABORATORIO
MUTAGÉNESIS
IN VITRO Y
DIRIGIDA
 MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
MÉTODO QUE HACE USO DE ADN SINTÉTICO
Y LAS TÉCNICAS DEL ADN RECOMBINANTE
PARA INTRODUCIR MUTACIONES EN SITIOS
DETERMINADOS CON TOTAL PRECISIÓN EN
LOS GENES.

PASOS BÁSICOS

1) SÍNTESIS DEL OLIGONUCLEOTIDO

CONTENIENDO EL CAMBIO DE BASE
DESEADO
2) EXTENSIÓN USANDO DNA POLIMERASA Y
EL OLIGO COMO CEBADOR
3) TRANSFORMACIÓN
4) SELECCIÓN DEL MUTANTE,
(GENERALMENTE SE USA COMO VECTOR
EL BACTERIOFAGO M13)
 MUTAGÉNESIS CON MUTAGÉNESIS
CASETE E CON CASETE
INTERRUPCIÓN GÉNICA
MÉTODO MEDIANTE EL CUAL
SE INSERTA UN GEN
INDICADOR DENTRO DE OTRO
GEN BLANCO CON EL FIN DE
INTERUMPIR ESTE ÚLTIMO.

PASOS BÁSICOS
1) CORTAR CON LAS MISMA
ENZIMA DE RESTRICCIÓN EL
GEN BLANCO, CLONADO EN
UN VECTOR, Y EL “CASETE”
2) LIGAZON Y LUEGO
LINEALIZAR VECTOR
RECOMBINANTE CON OTRA
ENZIMA
3) TRANSFORMACIÓN
4) SELECCIÓN DEL
RECOMBINANTE CON EL
NUEVO MARCADOR
TÉCNICAS DE
CLONACIÓN
GENÓMICA
GENÓMICA:
DISCIPLINA QUE SE OCUPA DEL
MAPEO, SECUENCIACIÓN Y
ANÁLISIS DE LOS GENOMAS
AVANCES DE TRASCENDENCIA EN LA GENÓMICA

1976 Secuenciado el primer genoma de virus correspondiente al ARN del

virus MS2 conteniendo 3569 ribonucleotidos
1977 Secuenciado el primer genoma de ADN correspondiente al ADN
monocatenario de fago X174 conteniendo 5386 nucleotidos

1995 Secuenciado el primer genoma de bacteria correspondiente a

Haemophilus influenzae conteniendo 1830137 pares de bases

2000 Secuenciado el genoma humano que contiene unos 3 millones de pares

de bases
 VECTORES PARA LA CLONACIÓN
GENÓMICA Y SECUENCIACIÓN
VECTORES DERIVADOS DEL
BACTERIOFAGO M13
• M13 es un bacteriófago
de ADN monocatenario
• Los viriones se liberan por
un proceso de gemación
(es posible obtener
cultivos infectados que
proporcionan una fuente
continua de ADN fágico)
• Pueden mantener hasta 2
Kb de ADN clonado

4) Son adecuados para desarrollar genotecas o llevar a cabo

reacciones de secuenciación (método de Sanger)
 VECTORES PARA LA CLONACIÓN
GENÓMICA Y SECUENCIACIÓN

CROMOSOMA ARTIFICIALES
1) Cromosoma Artificial de Levadura (YAC): Se diseñaron para
que se repliquen como cromosomas normales en eucariota;
contienen un origen de replicación, telómeros y un
centrómero que le permite segregar durante la mitosis
celular. Cuenta además con marcadores de selección que
restauran un fenotipo en la célula hospedera
2) Los vectores tipo YAC son de aproximadamente 10 Kb,
pero pueden aceptar DNA entre 200-800 Kb.
 VECTORES PARA LA CLONACIÓN
GENÓMICA Y SECUENCIACIÓN
CROMOSOMA ARTIFICIALES
• Los Cromosomas Artificiales de
Bacterias (BAC): Son vectores
derivados del plásmido F
• Son vectores de aproximadamente
6.7 Kb en lugar de los 99.2 del
plásmido F
• Contienen algunos genes originales
del plásmido F como los
necesarios para la replicación
(oriS y repE) y para mantener un
número bajo de copias (sopA y
sopB)
4) Se les insertó el gen de resistencia al Cloranfenicol (cat)
5) En su región de clonación se pueden insertar hasta 300 Kb
6) El hospedero generalmente es E. coli con sistemas de restricción y
recombinación defectivos imposibilitados de modificar el ADN
 CLONACIÓN Y MAPAS GENÉTICOS

LOCALIZACIÓN DE POSIBLES
GENES:

1) Los genomas microbianos

consisten de secuencias
interrumpidas de Marcos de
Lecturas Abiertos (ORF)
2) La estructura de lo ORF
permite identificar genes
funcionales en los genomas en
estudio
3) Son requeridos programas
específicos para llevar a cabo
Los estudios genómicos
 GENOMAS
MICROBIANOS
GENOMA PROCARIÓTICOS

ENTRE LAS
PRINCIPALES
FUNCIONES DE LA
GENÓMICA SE
ENCUENTRA
IDENTIFICAR EL
NÚMERO Y
FUNCIÓN DE LOS
GENES EN
LOS DIFERENTES
ORGANISMOS
 GENOMA PROCARIÓTICOS

1) Se han
secuenciado cerca
de 2000 genomas
microbianos

2) El tamaño de los
Genomas esta entre
0.6 y 8.7 Mpb

3) El rango de ORF
Se encuentra entre
470 y 7846
GENOMA PROCARIÓTICOS
GENOMAS EUCARIÓTICOS
EVOLUCIÓN Y FAMILIAS GENÉTICAS
(GENÓMICA COMPARATIVA)
LA GENÓMICA COMPARATIVA NOS AYUDA A ENTENDER:

• COMO LOS ORGANISMOS SE ADAPTAN Y VIVEN EN SU

ENTORNO

• LAS RELACIONES EVOLUTIVAS ENTRE LOS DIFERENTES

ORGANISMOS Y DISTINGUIR LAS FORMAS ANCESTRALES DE
VIDA Y LAS FORMAS DERIVADAS DE ELLAS; Y POR ENDE,
ENTENDER COMO SE GENERÓ LA VIDA EN LA TIERRA

• COMO ESTA DISPUESTA LA INFORMACIÓN GENÉTICA, POR

EJEMPLO FAMILIAS DE GENES EN LOS DIFERENTES
ORGANISMOS, Y CUALES SON LOS EVENTOS QUE
DETERMINAN ESTOS PROCESOS

• LA IMPORTANCIA Y PAPEL DE LA TRANSFERENCIA

HORIZONTAL DE GENES ENTRE MICROORGANISMOS
 FUNCIÓN
GÉNICA Y
REGULACIÓN
 PROTEÓMICA
UN PROTEOMA ES EL CONJUNTO DE
TODAS LAS PROTEINAS DE UNA
CÉLULA, TEJIDO U ORGANISMO EN UN
MOMENTO CONCRETO.

PROTEÓMICA O GENÓMICA
FUNCIONAL ES EL ESTUDIO A GRAN
ESCALA, EN EL ÁMBITO DEL GENOMA,
DE LAS PROTEINAS (ESTRUCTURA,
FUNCIÓN Y REGULACIÓN) DE UN Electroforesis bidimensional
ORGANISMO de poliacrilamida

GENÓMICA ESTRUCTURAL ES LA
DETERMINACIÓN DE LAS ESTRUCTURAS
TRIDIMENCIONALES DE LAS PROTEINAS
REPRESENTATIVAS DE UN ORGANISMO
MICROMATRICES
METAGENÓMICA: Estudia la información
genómica de la población microbiana de un
determinado hábitat

Extracción de DNA
genómico

DNA genómico Vector digerido

heterólogo por restricción

DNA vector

Librería
metagenómica
LITERATURA:
ANÁLISIS EVOLUTIVO / Freeman S., Herron JC., / 2da
Edición, Pearson Educación S.A., Madrid, 2002.

BROCK- BIOLOGY OF MICROORGANISMS /Madigan et al.

(Eds), International 15th Edition, Pearson Education, NY, USA,
2018.

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR. Conceptos y

experimentos / Karp G. / 4ta Edición, McGraw-Hill
Interamericana, Mexico, 2006.