Tecnología de ADN recombinante

Garrido, A., Villaverde, C., Blanco, M., Teijón, J., Mendoza, C., Ramírez, J. (2006).
Tema 25: Tecnología de ADN recombinante. En Fundamentos de Bioquímica
Metabólica (3a Ed., Pág. 337-352). Madrid: Editorial Tébar.

Espacio de
Formación
Multimodal
 Tecnología de
TEMA 25 ADN recombinante

Fundamentos de la clonación. Vectores de clona-

ción. Estrategia de la clonación. Aplicaciones a las
ciencias médicas.

La tecnología del ADN recombinante comprende una serie

de métodos para identificar un gen (o segmentos concretos de
ADN) en un organismo, aislarlo, analizarlo, si es preciso, modi-
ficarlo y reinsertarlo dentro de otro organismo consiguiendo
que se exprese con normalidad.
Los objetivos de este conjunto de técnicas son, principal-
mente:

1. Obtener grandes cantidades del producto del gen.

2. Conocer las consecuencias de una determinada modifi-
cación del gen en el funcionamiento celular.
3. Sustituir un gen defectuoso por otro normal.

Estas técnicas han permitido un avance considerable de la

biología y genética molecular, la medicina, la agricultura y la
ecología. En medicina están proporcionando nuevos métodos
de diagnóstico, de agentes terapéuticos y revelando el mecanis-
mo molecular de diversas enfermedades.

FUNDAMENTOS DE LA CLONACIÓN

El conjunto de bacterias que surgen de una bacteria aislada

en una placa de cultivo, y que se conoce como colonia, es, sen-
cillamente, un clon. Clonar es hacer copias idénticas de unos
organismos, células, virus o moléculas de ADN derivadas de la
replicación de un único progenitor genético. Mediante la clona-
ción se puede disponer de cantidades suficientes de un único
tipo de células.

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338 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

Etapas de la clona- La clonación de un gen o un fragmento de ADN implica la

ción: separación del resto del genoma, la unión a una molécula por-
1. C o r t e d e l A D N
genómico por si- tadora y la inserción en un organismo para poder amplificarlo
tios específicos. muchas veces. Con este procedimiento se pueden obtener mi-
2. Elección de molé- les e incluso millones de copias del gen o fragmento de ADN
culas de ADN (vec-
tores) capaces de inicial.
autorreplicarse. La clonación requiere básicamente las siguientes etapas:
3. Unión de los frag-
mentos de ADN a 1. Corte del ADN genómico por sitios específicos y obten-
los vectores. ción de los fragmentos de ADN.
4. Introducción de
los fragmentos de 2. Elección de moléculas de ADN (vectores) capaces de
ADN-vector en cé- autorreplicarse y corte específico de las mismas.
lulas huésped. 3. Unión de los fragmentos de ADN a las moléculas auto-
5. Selección e identi-
ficación de células rreplicativas (recombinación).
huésped con el vec- 4. Introducción de ambas en una célula huésped.
tor e inserto ade- 5. Selección e identificación de células huésped que contie-
cuado.
nen el ADN recombinante.
El corte del genoma para obtener fragmentos de ADN se
realiza mediante enzimas de restricción o endonucleasas de res-
tricción. Estas sustancias reconocen secuencias específicas de
ADN de doble cadena y cortan ambas en lugares específicos.
Las secuencias reconocidas son palindrómicas, esto es, poseen
simetría rotacional respecto a un eje. Los cortes son de dos ti-
Las enzimas de res- pos: uno en que se cortan las cadenas simétricamente respecto
tricción reconocen y a un eje y otro en que se cortan en el mismo punto. El primero
cortan ADN de doble
cadena por sitios es- deja extremos cohesivos o adhesivos y el segundo extremos ro-
pecíficos. mos (Fig. 25.1).

Las palabras o frases

palindrómicas son
aquellas que son
iguales se comience
por la primera o por
la última letra:
– Radar.
– Dábale arroz a la
zorra el abad.

Figura 25.1.– Especificidad de las enzimas de restricción. La Ban H1 y

la Eco RI dejan extremos cohesivos y la HhaI romos.

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TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 339

Figura 25.2.– Fragmentos de ADN obtenidos de un genoma con diferentes en-

zimas de restricción. Los fragmentos de mayor tamaño son los de parte su-
perior. El tamaño de los fragmentos se conoce comparando con fragmentos
patrones de longitud conocida.

Se han caracterizado y purificado cientos de enzimas a la

que se denomina por una abreviatura correspondiente a la es-
pecie bacteriana de la que derivan. Así, Bam de Bacillus am-
gloliquefaciens, Eco de Escherichia coli, Hal del Haemophilus
aegyptius, etc.
Los fragmentos de ADN resultantes dependiendo del ta-
maño, se pueden separar por electroforesis en geles de poliacri-
lamida o agarosa; los geles de poliacrilamida separan fragmen-
tos de unos mil pares de bases y los de agarosa de 15.000 a
20.000 pares de bases. Los fragmentos se separan en bandas
que se pueden visualizar añadiendo a la disolución de los geles
colorantes como bromuro de etidio, que a la luz ultravioleta
presenta una intensa fluorescencia de color naranja. La longi-
tud o tamaño de los fragmentos de ADN se puede conocer me-
diante la comparación de las bandas con fragmentos patrones
de longitud conocida (marcadores). Cada fragmento de ADN
se puede purificar cortando la banda correspondiente del gel,
eliminando la matriz del gel y el colorante.

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340 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

Para identificar en cuál de las bandas se encuentra el gen o

la secuencia de ADN de nuestro interés se suele realizar una hi-
bridación. Esta técnica consiste en desnaturalizar los fragmen-
tos de ADN que aparecen en el gel después de la eletroforesis y
transferirlos a membranas de nitrocelulosa o nylon. Las posi-
ciones de los fragmentos en el gel se mantienen en la membra-
na. Después la membrana se introduce en una disolución que
Una sonda es un frag- contiene una sonda radiactiva marcada con 32P (Fig. 25.3).
mento de ADN (o Posteriormente se observa por autorradiografía el fragmento o
ARN) monocatenario
con el fosfato final fragmentos de restricción que posean una secuencia comple-
marcado con 32P. mentaria a la sonda y que, por consiguiente, haya hibridado
con ella. Esta técnica se denomina trasferencia Southern (Sout-

Figura 25.3.– Transferencia e hibridación de ADN (o Southern blotting). Cada

banda radiactiva en la película corresponde al fragmento de ADN de interés.

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TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 341

hern blotting) en honor a su diseñador E. M. Southern. De for-

ma similar se pueden separar moléculas de ARN por electrofo-
resis en gel e identificar secuencias concretas por hibridación.
En este caso se denomina transferencia Northern. También se
puede aplicar esta técnica para detectar una proteína determi-
nada uniéndola a un anticuerpo específico y entonces se deno-
mina transferencia Western. Resumiendo, las técnicas Sout-
hern, Northern y Western se corresponden respectivamente
con las transferencias de ADN, ARN y proteína.

VECTORES DE CLONACIÓN

En E. coli, el microorganismo que más se emplea en clona- Vectores de clona-

ción y el mejor conocido molecular y funcionalmente, se utili- ción:
– Plásmidos: pBR322
zan tres vectores o vehículos de clonación: los plásmidos, los pBR328
bacteriófagos y los cósmidos. Los plásmicos son moléculas de – Bacteriófagos: Fago
ADN circular de doble cadena extrageniomales y que se repli- l, T2, Fago m.
– Cósmidos.
can independientemente del cromosoma bacteriano. Su ta-
maño oscila entre 2 y 400 kilopares de bases (Kpb), transpor-
tan genes para la inactivación de antibióticos, producción de
toxinas y degradación de productos naturales. Los plásmidos
no son imprescindibles para la vida de las bacterias, algunas no
contienen ninguno y otras pueden contener hasta veinte. Se Conjugación bacte-
pueden clasificar en conjugativos y no conjugativos dependien- riana. Una bacteria
transfiere a través de
do de si llevan o no un conjunto de genes de transferencia, de- un pili un cordón de
nominados trans, que favorece la conjugación bacteriana es su genoma a otra
decir, la transferencia de material genético de una bacteria a bacteria.
otra. Los plásmidos también se pueden introducir sin el concur-
so de ningún elemento por transformación.
Tanto en el proceso de conjugación como en el de transfor-
mación para detectar el ADN plásmidico, se necesita un méto-
do de selección. La estrategia más común es introducir en el
plásmido un gen que la célula huésped necesita para crecer
bajo determinadas condiciones o un gen que confiera resisten-
cia frente a un antibiótico, en este caso sólo aquellas células
bacterianas que porten el plásmido serán resistentes al antibió-
tico y podrán crecer en medios que lo contengan.
Uno de los plásmidos más utilizados es el pBR322, que con-
tiene genes de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina. El
plásmido contiene una serie de sitios específicos que pueden
ser cortados por enzimas de restricción para introducir frag-
mentos de ADN. La inserción de ADN en el punto de corte de
EcoRI no altera ninguno de los dos genes de resistencia a los
antibióticos. Sin embargo, la inserción en los puntos de corte a
los Hind III, Pal 1I o Ban HI inactiva el gen de resistencia a la

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342 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

Figura 25.4.– Plásmido pBR322. Se indican los puntos de corte de algunas

enzimas de restricción y las zonas que codifican resistencia a tetraciclina y am-
picilina.

Figura 25.5.– Transducción o infección por fagos de una bacteria. El ADN del
fago controla el sistema metabólico y replicativo bacteriano y termina por des-
truirla. En algunos casos el ADN del fago se inserta en el de la bacteria.

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TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 343

tetraciclina, y el PstI resistencia a amplicilina. Las células bacte-

rianas que contengan pBR322 con un fragmento de ADN in-
sertado en el punto de corte de, por ejemplo, Hind III, son re-
sistentes a la ampicilina y sensibles a la tetraciclina, y se pue-
den seleccionar fácilmente observando las colonias que crecen
en amplicilina y no aparecen en la placa que contiene tetracicli-
na. Las células que no portan el plásmido son sensibles a los

Figura 25.6.– Identificación de la colonia bacteriana que porta

el vector con el fragmento de ADN de interés.

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344 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

Figura 25.7.– Esquema de clonación de un fragmento de ADN procariótico en

E. coli con pBR322 (ampR ampicilina resistente, tetR tetraciclina resistente).

dos antibióticos, mientras los que lo portan, pero no llevan in-

sertado el ADN, son resistentes a ambos.
El bacteriógrafo más utilizado como vector es el fago O. Este
bacteriógrafo tiene un mecanismo muy eficaz para introducir
más de 48 Kpb de ADN en la bacteria. El procedimiento gene-
ral para clonar ADN en el fago O se basa en dos características
de su genoma:
1) Cerca de un tercio de su genoma puede ser reemplaza-
do por ADN foráneo.

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TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 345

2) El ADN se empaqueta en partículas de fago de alrede-

dor de 40-50 Kpb.
Cuando los fragmentos de ADN de un tamaño adecuado se
ligan al ADN del fago, los ADN resultantes se pueden empa-
quetar dentro de partículas de fago, por adicción de extracto
crudo de células bacterianas que contienen todas las proteí-
nas necesarias para ensamblar un fago completo. Ese proce-
so se denomina empaquetamiento in vitro. Los fagos pue-
den infectar bacterias de E. coli bien destruyéndolas o inser-
tando su ADN en el genoma de la bacteria. En este último
caso el ADN del fago se replica junto al ADN de la célula
durante muchas generaciones. Ciertos cambios ambientales
pueden poner en marcha la expresión del ADN del fago y
desencadenan los procesos que conducen a la lisis de la
bacteria.
Los cósmidos están construidos a partir de plásmidos y ge- Los cósmidos están
nes O. Los cósmidos son moléculas de ADN pequeñas construidos a partir de
plásmidos y genes l.
(5-7 Kpb), circulares y con las siguientes características:
1) Un origen de replicación plasmídico.
2) Uno o más marcadores seleccionables.
3) Varios sitios de restricción donde se puede insertar el
ADN exógeno y
4) Un sitio cos, que es una secuencia de ADN del bacterió-
fago que se necesita en el equipamiento.

Genotecas. Una genoteca es una colección de fragmentos

derivados del genoma de un organismo insertados en un vec-
tor de clonación. El vector se introduce en microorganismos
(generalmente bacterias o levaduras) de tal forma que cada cé-
lula contenga un fragmento del ADN recombinante. El procedi-
miento se basa en romper el ADN en muchos fragmentos y,
posteriormente, clonarlos todos. Esto es, la información conte-
nida en un organismo está representada en el conjunto de frag-
mentos de la genoteca. Los fragmentos se insertan en el ADN
de un vector previamente tratado en la misma enzima de res-
tricción que se ha utilizado para la rotura del ADN. La mezcla Las genotecas son
(fragmento ADN-vector) se usa para transformar las células colecciones de frag-
mentos obtenidos del
bacterianas o se empaqueta en partículas de fago. El resultado genoma de un orga-
final es una serie de bacterias o fagos en que cada portador de nismo e insertados en
una molécula de ADN recombinante es diferente. Al conjunto vectores de clonación.
de todos ellos se le denomina genoteca, librería genómica o bi-
blioteca genómica.
Para identificar el gen de interés en una genoteca se hacen
crecer las bacterias en medio sólido de forma que en las placas
se puedan apreciar colonias bacterianas individuales.

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346 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

Posteriormente, se procede como anteriormente, esto es, se

tratan las bacterias con álcali para desnaturalizar su ADN y se
transfieren las células a una membrana de nitrocelulosa o ny-
lon. Posteriormente, las placas se sumergen en una disolución
que contiene una sonda de ADN marcada radiactivamente que
hibrida con el ADN del gen complementario. Se lava la placa y
se expone a una película de rayos X, las manchas que apare-
cen en la película indican la posición de las colonias portadoras
del inserto de ADN de interés.

ESTRATEGIA DE LA CLONACIÓN

La clonación de ge- La clonación de un gen es un procedimiento en teoría relati-

nes eucariotas no se vamente sencillo. Si el ADN procede de una célula bacteriana,
puede realizar direc-
tamente del ADN, ya una vez extraído y purificado se trata con una enzima de restric-
que éste está consti- ción que deje extremos cohesivos. Si se elige como vector de clo-
tuido por exones e in- nación, un plásmido (pBR322) se corta con la misma enzima de
trones.
restricción para que queden extremos que se complementen con
los de los fragmentos de ADN. Ambos elementos se unen me-
diante la ADN ligasa. Los plásmidos con el inserto sufren una
primera selección en placas con antibióticos a los que son resis-
tentes. Posteriormente, bien con una sonda, de forma semejante
Los intrones no se tra- a como se identifican los fragmentos de ADN, o bien extrayendo
ducen y las bacterias el plásmido, cortándolo en la misma enzima de restricción y rea-
no tienen mecanismos
para eliminarlos. lizando electroforesis se pueden seleccionar aquellas células bac-
terianas que llevan el plásmido con el inserto de ADN de interés.
La clonación de genes eucarióticos (vegetales o animales)
planteó, al principio, serios problemas, puesto que la mayoría
de sus genes son un conjunto de intrones y exones. Por ello, es-
La transcriptasa in- tos genes no pueden ser expresados en bacterias que carecen
versa sintetiza ADN de la maquinaria necesaria para cortar los intrones y eliminar-
partir de ARNm. El
ADN obtenido se de- los del transcrito. Esta dificultad se supera introduciendo en la
nomina ADNc (ADN bacteria plásmidos con fragmentos de ADN complementario
complementario). (ADNc) del ARNm. Esto es, existe una enzima denominada
transcriptasa inversa que sintetiza ADN a partir de un ARNm.
Para su acción la enzima requiere:
a) Los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP);
b) ARNm purificado.
Posteriormente, se forma un doble cordón ADN-ARN que
se somete a degradación alcalina para hidrolizar el ARN. El
ADN monocatenario o de simple cordón se trata con ADN po-
limerasa que requiere los 4 dNTP, un cebador o “primer” y la
cadena de ADN que le sirve de molde. El resultado es un frag-
mento de ADN bicatenario que se denomina ADNc.

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TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 347

Figura 25.8.– Síntesis de ADN complementario (ADNc) a partir de

ARNm de un órgano de mamífero.

A partir de este ADNc el procedimiento sigue el mismo ca-

mino que la clonación de fragmentos de ADN de células proca-
rióticas.

Técnicas en ingeniería genética: PCR y secuenciación

de ADN.
Existen dos técnicas que han supuesto un avance especta-
cular en la investigación sobre el ADN genómico:
a) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
b) La secuenciación de fragmentos de ADN.
Anteriormente hemos estudiado que la clonación del ADN
genómico permite lograr dos objetivos importantes: Primero
separa cada fragmento de ADN de los demás del genoma, y
segundo, amplifica segmentos de ADN seleccionados. Después
de que el ADN o región particular del ADN ha sido clonado,
debe conocerse su secuencia.
La técnica de PCR permite obtener millones e incluso miles La técnica de PCR
de millones de copias de cualquier secuencia seleccionada del permite obtener mi-
llones de copias de
ADN genómico en unas pocas horas. Una propiedad importan- un fragmento de ADN
te de esta técnica es que no hace falta que el segmento de sin necesidad de se-
ADN elegido sea separado del ADN genómico antes de co- pararlos previamente
del genoma.
menzar el procedimiento de amplificación. Sin embargo, una
vez que se ha amplificado, el segmento puede separarse fácil-
mente del resto de ADN (que no se ha amplificado) mediante
la electroforesis en gel.

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348 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

Una mezcla de reac- La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realiza en

ción de PCR contie- un tubo de plástico de pequeña capacidad (0,2 ml) al que se
ne:
1. Genoma o fragmen- añaden los siguientes componentes: El fragmento de ADN de
to de ADN. doble cadena que se desea amplificar, las cuatro dNTP, el “pri-
2. Los cuatro desoxi- mer” o cebador y un ADN, polimerasa estable al calor. Esta
rribonucleósido tri-
fosfato. ADN polimerasa (taq) procede de la bacteria termófila Ther-
3. Un “primer” o ce- mus acuaticus y es estable y activa a 72 ºC.
bador. Un ciclo de PCR consta de 5 etapas, dos de ellas, la inicial y
4. La enzima taq.
final, se realizan solamente una vez y las tres intermedias un
número prefijado de veces que se denominan ciclos (entre 25 y
40) (Fig. 25.9).

Figura 25.9.– Esquema de la etapa cíclica de la reacción en cadena de la ADN

polimerasa. Después de un ciclo se amplifica el ADN dos veces; después de 25
el fragmento de ADN se puede amplificar unas 106 veces.

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TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 349

Las tres etapas intermedias son:

a) Separación de las cadenas de ADN por calentamiento
(94-95 ºC) durante unos segundos.
b) Hibridación de los cebadores. La disolución se enfría
(52-54 ºC) para que se unan las cadenas de ADN se-
paradas.
c) Síntesis de ADN. Se calienta la disolución (72 ºC) para
que la ADN polimerasa sintetice nuevas cadenas de
ADN a partir de los cebadores.
Estas tres etapas (separación de las hebras, hibridación de 2', 3'- didesoxirribo-
los cebadores y síntesis de ADN) se llevan a cabo repetitiva- nucleósido trifosfato.
El compuesto impide
mente cambiando únicamente la temperatura de la mezcla de el crecimiento de la
reacción. No es necesario añadir ningún reactivo después del cadena porque carece
primer ciclo. El fragmento de ADN se puede ampliar según 2n, de grupos hidroxilo
en los carbonos 2' y
siendo n el número de ciclos; esto es, después de 25 ciclos se 3'.
puede amplificar unas de 106 veces (Fig. 25.10).

Figura 25.10.– Diagrama de una reacción de PCR típica. Los números por en-
cima de la línea indican la temperatura y por debajo el tiempo en minutos:
segundos.

El análisis de la estructura del ADN se puede realizar por 3'AGTAGACATGAC

varios métodos, pero el que se utiliza casi con exclusividad en GA5' 5'TC3'
los últimos años es el desarrollado por F. Sanger y colaborado- 3'AGTAGACATGAC
res y que se denomina “método por interrupción controlada de GA5' 5'TCATC3'
la replicación enzimática”.
3 ' A G TA G A C T G A C
El método para secuenciar un fragmento de ADN se basa GA5'
en copiar uno de los cordones de ADN mediante la ADN poli- 3'TCATCT6AC3'
merasa. El cebador para la síntesis es un fragmento comple- 3'AGTAGATGAC6G
A5'
mentario que se puede obtener por digestión con una enzima 5'TCATCTGAC3'
de restricción o por síntesis química. La reacción contiene
además los cuatro desoxirribonucleósido trifosfato, un análogo,
2c, 3c-didesoxirribonucleósido trifostato, de una base, el cual Fragmentos de ADN
de distintos tamaños
impide, cuando se introduce en la cadena, un crecimiento pos- obtenidos en la sínte-
terior de esta. Como el compuesto entra en la cadena al azar, sis de una cadena
se producen fragmentos de distinta longitud. El proceso se repi- cuando en la mezcla
de reacción se incor-
te con otra muestra del fragmento original y el análogo cargado pora 2,3-didesoxiciti-
con otra base diferente. Los cebadores se marcan con una sus- din trifosfato.

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350 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

tancia con diferente color según sea la base terminal, así, azul
para adenina, rojo para citosina, verde para timina y amarillo
para guanina.
Las mezclas de reacción se juntan y se someten a electrofo-
resis. Las bandas separadas de ADN se detectan por fluores-
cencia al salir del gel, y la secuencia de colores se corresponde
con la de las bases. El método se realiza en un aparato auto-
mático de secuenciación que puede determinar de una vez cer-
ca de un millar de bases.

APLICACIONES A LAS CIENCIAS MÉDICAS

Los descubrimientos producidos en los últimos años utili-

zando las técnicas de ADN recombiante o Ingeniería genética y
los relacionados con ellas han permitido obtener un mejor co-
nocimiento de la estructura, organización y expresión de los ge-
nes, y han posibilitado su aplicación en diferentes campos de
las ciencias. En medicina la aplicación de estas técnicas ha
abierto nuevas esperanzas en el diagnóstico, prevención, detec-
ción y terapia de varias enfermedades.
Las técnicas de ADN recombinante han permitido la inser-
ción y expresión de genes, que codifican productos de interés
Aplicaciones de la In-
biomédico en bacterias, levaduras, y el crecimiento a escala in-
geniería genética a dustrial ha facilitado la obtención de cantidades apreciables de
las ciencias médicas: proteínas y péptidos humanos de gran utilidad para el trata-
– Conocer la función
y expresión de los
miento de determinadas enfermedades que hasta entonces se
genes. obtenían sólo en pequeñas cantidades de tejidos animales o de
– Obtener substan- cadáveres.
cias con fines te-
rapéuticos en canti- La mayor parte de las enfermedades genéticas no tienen un
dades adecuadas. tratamiento eficaz, y las que lo tienen se basan tanto en el
– Diagnóstico precoz aporte periódico de sustancias que el organismo no puede fa-
de enfermedades.
– Obtención de ani- bricar, como en evitar la acumulación de un producto nocivo
males transgénicos. provocado por la carencia de la enzima necesaria para su me-
– Terapia génica. tabolismo. Una solución terapéutica sería la inserción del gen
– Aplicaciones de la
técnica del PCR. normal en las células defectuosas del individuo enfermo y su
– Detectar virus y expresión correcta; este proceso se denomina terapia génica.
bacterias en los te- Para aplicar esta clase de terapia es necesario, principalmente,
jidos.
– Detectar cánceres conocer el gen defectivo y clonar el gen homólogo normal.
en estadios preco- Posteriormente, hay que saber en qué células suele estar activo,
ces. éste es punto clave del proceso porque un gen sólo puede ser
– Determinar el pa-
rentesco entre indi- insertado en células accesibles, por ejemplo, células de la san-
viduos. gre o de la piel. Actualmente se están ensayando varios proto-
– Identificar indivi- colos clínicos para el tratamiento de enfermedades genéticas
duos mediante la
“huella dactilar del como la carencia de adenosina desaminasa (ADA), la fibrosis
ADN”. quística, las anemias hemolíticas, la hemofilia, etc.

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TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE 351

La obtención de animales transgénicos mediante la mi-

croinyección de embriones con el gen o por transducción con
retrovirus ha permitido obtener fundamentalmente ratones
transgénicos que tienen gran interés como modelos de enfer-
medades génicas como la enfermedad de Tay-Sachs y la Dia-
betes mellitus.
Por otra parte, la técnica de PCR también está proporcio-
nando una ayuda valiosa a las ciencias médicas. Mediante esta
técnica se pueden detectar la presencia de bacterias y virus en
la sangre y tejidos de un individuo antes de que éste desarrolle
una respuesta inmune. También se pueden detectar cánceres
en un estadio temprano. En medicina forense esta técnica per-
mite conocer el parentesco de personas. Un simple cabello, una
pequeña mancha de sangre o de semen suelen ser suficientes
para obtener cantidades adecuadas de ADN para un análisis
posterior. Otra aplicación interesante es en el transplante de ór-
ganos. En este proceso el aceptor rechaza el órgano cuando los
antígenos HLA del donante no son suficientemente parecidos a
los del aceptor. La amplificación de los genes por PCR permite
determinar los tipos de HLA y comprobar sus diferencias o
analogías.

RESUMEN

La tecnología del ADN recombinante o Ingeniería

genética ha supuesto un desarrollo extraordinario en el co-
nocimiento de las bases moleculares de la vida. El diseño
y construcción de moléculas recombinantes se basa en el
conocimiento de los mecanismos de replicación del ADN,
de la estructura, de la organización y de la regulación de la
expresión génica.
La clonación de un gen o fragmento de ADN de célu-
las procariotas requiere un corte específico del ADN genó-
mico por enzimas de restricción, y la elección de un vector
adecuado para unir el gen. Los vectores más utilizados son
los plásmidos, los baceteriofagos y los cósmidos. El vector
con el gen se introduce en células hospedadoras para su
multiplicación. La identificación de las células con el inser-
to de interés se suele realizar mediante sondas radiactivas
según la técnica de transferencia de Southern. La clona-
ción de genes de células eucarióticas requiere la obtención
previa del ADN a partir de ARNm mediante la transcripta-
sa inversa.

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352 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

La información contenida en el ADN de un organismo

se puede fragmentar, unirse a vectores de clonación y al-
macenarse. Al conjunto de todos ellos se denomina geno-
teca o librería de genes.
Dos técnicas han permitido un avance espectacular de
la Ingeniería genética: La de la reacción en cadenada de la
polimerasa (PCR) y la secuenciación automática de nu-
cleótidos.
La aplicación de las técnicas de ADN recombinante
está mostrando su valiosa utilidad en el diagnóstico y pre-
vención de varias enfermedades y en las nuevas terapias a
aplicar.

APLICACIONES CLÍNICAS

La terapia génica en las enfermedades hereditarias se aplicó

por primera vez en 1990 a una niña de cuatro años que pa-
decía carencia de adenina desaminasa (ADA). Esta enzima del
sistema inmunológico y su deficiencia expone a los pacientes a
contraer fácilmente enfermedades infecciosas. El gen que codi-
fica la ADA suele estar activo en los linfocitos, por lo que fue
relativamente fácil extraer esas células de la sangre del paciente
e identificarlo.
Posteriormente, se introdujo el gen correcto en células pre-
cursoras de los linfocitos utilizando vectores basados en retrovi-
rus. Este proceso permitió la corrección de la enfermedad debi-
do a la deficiencia de ADA.
Otros casos susceptibles de aplicar una terapia génica son
aquellos en los que el gen alterado es el responsable de la pro-
ducción de una sustancia presente en la sangre, donde su fun-
ción es necesaria, por ejemplo, en las enfermedades hemofíli-
cas debidas a la carencia de un factor de coagulación. En estos
caso se puede insertar el gen correcto en cualquier tipo de cé-
lula del mismo organismo con tal de que éste pueda sintetizar
el producto e introducirlo en la sangre. Hay bastantes tipos de
células capaces de realizar esta función, como las células del te-
jido conjuntivo subcutáneo, de la epidermis o de los músculos.

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