A U TO N O M A D E TLAXCALA

UNIVERSIDAD D E LA SALUD
A D C IE N C IA S
FACULT A CLÍNICA
U R A E N Q U ÍM IC
LICENCIAT

BIOLOGIA MO L E C U L A R
NA G U A DA LU P E R O DR ÍGUEZ SANTIAGO
DOCENTE: MAGDALE RD O PA IS ANO ALVAREZ
ALUMNO: BR A ND EN E DU A
 • EL INTENTO DE ALTERAR O MEJORAR
RASGOS HUMANOS COMPLEJOS, TALES
COMO LOS QUE SON CODIFICADOS POR
UN GRAN NÚMERO DE GENES.

MANIPULACIÓN GENÉTICA TEMA 2

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE
MOLÉCULA QUE PROVIENE DE LA UNIÓN ARTIFICIAL DE DOS FRAGMENTOS DE ADN.
ES EL CONJUNTO DE TÉCNICAS QUE PERMITEN AISLAR UN GEN DE UN ORGANISMO,
PARA SU POSTERIOR MANIPULACIÓN E INSERCIÓN EN OTRO DIFERENTE.
¿CÓMO INTRODUCIR ADN RECOMBINANTE EN LAS
BACTERIAS?

• CORTAMOS EL ADN CIRCULAR DEL PLÁSMIDO CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN, PARA GENERAR
EXTREMOS COHESIVOS.

• CORTAMOS EL ADN QUE QUEREMOS MULTIPLICAR. DEBEMOS ASEGURARNOS DE QUE LOS EXTREMOS
DEL PLÁSMIDO Y LOS DEL ADN A INSERTAR SEAN COMPLEMENTARIOS Y PUEDAN UNIRSE.

• UNIMOS EL GEN QUE QUEREMOS INTRODUCIR (INSERTO) POR MEDIO DE LA ENZIMA ADN-LIGASA Y
LUEGO INTRODUCIMOS EL PLÁSMIDO CON INSERTO EN BACTERIAS.

• SELECCIONAMOS LAS BACTERIAS QUE HAYAN INTRODUCIDO EL PLÁSMIDO CON LA AYUDA DE

ANTIBIÓTICOS. DADO QUE LOS PLÁSMIDOS CONTIENEN UN GEN DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICO, AL
EXPONER LAS BACTERIAS A ESE ANTIBIÓTICO, SÓLO LAS QUE HAYAN INCORPORADO EL PLÁSMIDO (Y
CON ÉL LA RESISTENCIA) SOBREVIVIRÁN, MIENTRAS QUE LAS QUE NO LO TENGAN MORIRÁN.
 HERRAMIENTAS MOLECULARES
• LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR (BM)
PERMITEN LA DETECCIÓN DE MATERIAL
GENÉTICO (ÁCIDOS NUCLEICOS), TANTO DNA
COMO RNA, QUE CONSTITUYEN LA
CARACTERÍSTICA INEQUÍVOCA DE ESPECIE Y SUS
MODIFICACIONES COMO MUTACIONES,
DELECIONES Y TRANSLOCACIONES, LAS CUALES
TIENEN DIFERENTES IMPLICANCIAS SEGÚN LA
SITUACIÓN ESTUDIADA.
 ENZIMAS

DE RESTRICCIÓN: UNA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ES UNA PROTEÍNA AISLADA A PARTIR DE

BACTERIAS QUE CORTAN SECUENCIAS DE ADN EN SITIOS ESPECÍFICOS DE LA
SECUENCIA, LO QUE PRODUCE FRAGMENTOS DE ADN CON UNA SECUENCIA CONOCIDA
EN CADA EXTREMO.
POLIMERASAS: LA POLIMERASA ES UNA ENZIMA CAPAZ DE TRANSCRIBIR O REPLICAR
ÁCIDOS NUCLEICOS, QUE RESULTAN CRUCIALES EN LA DIVISIÓN CELULAR Y EN LA
TRANSCRIPCIÓN DEL ADN
NUCLEASAS: ENZIMA QUE ROMPE LA COLUMNA VERTEBRAL DEL ARN O DEL ADN. 
• LIGASAS: ES UNA ENZIMA QUE PUEDE CATALIZAR LA UNIÓN DE DOS MOLÉCULAS
GRANDES FORMANDO UN NUEVO ENLACE QUÍMICO
VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN
UN VECTOR DE CLONACIÓN CONTIENE ELEMENTOS COMO EL ORIGEN DE REPLICACIÓN, UN
SITIO MÚLTIPLE DE CLONACIÓN (SMC), QUE ES UNA SECUENCIA ESPECÍFICA RECONOCIDA
POR DIVERSAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN PARA PODER INSERTAR EL ADNC DEL GEN DE
INTERÉS Y UN MARCADOR DE SELECCIÓN.
• UN VECTOR DE EXPRESIÓN SE UTILIZA PARA PRODUCIR UNA PROTEÍNA
RECOMBINANTE Y CONTIENE, ADEMÁS DE LOS ELEMENTOS MENCIONADOS, UN
PROMOTOR Y UN SITIO IRES (SITIO DE ENTRADA INTERNA AL RIBOSOMA), ASÍ COMO
UNA SECUENCIA DE POLIADENILACIÓN.
HUÉSPEDES

DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS, FAGOS, CROMOSOMAS ARTIFICIALES BACTERIANOS O DE LEVADURA.

DE EXPRESIÓN: PLÁSMIDOS O FAGOS.
ELECTROFORESIS
• LA ELECTROFORESIS ES UNA TÉCNICA QUE
EMPLEAN LOS CIENTÍFICOS EN EL
LABORATORIO UTILIZADA PARA SEPARAR EL
ADN, EL ARN, O MOLÉCULAS O PROTEÍNAS EN
BASE A SU TAMAÑO Y CARGA ELÉCTRICA. SE
UTILIZA UNA CORRIENTE ELÉCTRICA PARA
MOVER LAS MOLÉCULAS Y QUE SE SEPAREN A
TRAVÉS DE UN GEL.
CLONACIÓN
• LA CLONACIÓN ES EL PROCESO
MEDIANTE EL CUAL, DE MANERA NO
SEXUAL, SE OBTIENEN DOS CÉLULAS,
MOLÉCULAS U ORGANISMOS IDÉNTICOS
YA DESARROLLADOS. UN CLON ES UN
ORGANISMO COPIA EN CUANTO A SU
GENÉTICA. 
TRANSFORMACIÓN
• PARA INTRODUCIR ADN FORÁNEO EN UNA
BACTERIA SE USA UNA TÉCNICA
LLAMADA TRANSFORMACIÓN
BACTERIANA, DONDE SE SOMETE AL
ORGANISMO A UN TRATAMIENTO CON
CATIONES DIVALENTES QUE LO HACE
SUSCEPTIBLE A LA TOMA DE ADN.
 • TODO VECTOR DE CLONACIÓN DEBE
CONTENER LOS SIGUIENTES
ELEMENTOS: ORIGEN DE REPLICACIÓN: ES
LA REGIÓN QUE CODIFICA PARA EL INICIO
DE LA SÍNTESIS DE DNA, EL CUAL LE DA LA
CUALIDAD DE PODER REPLICARSE DE
MANERA INDEPENDIENTE AL DNA
CROMOSÓMICO, YA SEA EN UN SISTEMA
BACTERIANO O EN UN SISTEMA DE
EXPRESIÓN EN LEVADURAS.

ELEMENTOS QUE FORMAN UN VECTOR DE CLONACIÓN

TEMA 3
•UN PLÁSMIDO CONSTA DE COMPONENTES BÁSICOS COMO EL SITIO DE CLONACIÓN
MÚLTIPLE, UN GENE DE RESISTENCIA Y UN SITIO ORI.
•
LOS FAGOS PROVIENEN DE LA MODIFICACIÓN DEL GENOMA ADND’S LINEAL DE VIRUS
BACTERIANOS. 
•
LOS CÓSMIDOS, COMO SU NOMBRE INDICA, COMBINAN PROPIEDADES DE LOS PLÁSMIDOS
CON LA PRESENCIA DE LOS SITIOS COS DEL FAGO.
•
UN BAC, O CROMOSOMA BACTERIANO, PERMITE LA LIGACIÓN DE FRAGMENTOS GRANDES
DE ADN QUE CONTIENEN SECUENCIAS DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS, Y SITIO DE
CLONACIÓN MÚLTIPLE. 
•
LOS YAC SE CONSTRUYEN A PARTIR DE LA LIGACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN DE GRAN
TAMAÑO CON GENOMAS DE LEVADURA MODIFICADOS QUE CONTIENEN GENES DE
RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS, SECUENCIAS TELOMÉRICAS Y DE CODIFICACIÓN PARA
CENTRÓMEROS.
PLASMIDOS
• LOS PLÁSMIDOS SON MOLÉCULAS DE ADN
EXTRACROMOSÓMICO GENERALMENTE
CIRCULAR QUE SE REPLICAN DE MANERA
AUTÓNOMA Y SE TRANSMITEN (ESTO
ÚLTIMO POR UN PROCESO LLAMADO
CONJUGACIÓN) INDEPENDIENTEMENTE DEL
ADN CROMOSÓMICO. ​​ESTÁN PRESENTES
PRINCIPALMENTE EN LOS PROCARIOTAS
(BACTERIAS Y ARQUEAS). ​
BACTERIOFAGO
• LOS BACTERIÓFAGOS SON VIRUS QUE INFECTAN
EXCLUSIVAMENTE A LOS ORGANISMOS
PROCARIOTAS. AL IGUAL QUE LOS VIRUS QUE
INFECTAN CÉLULAS EUCARIOTAS, LOS FAGOS
ESTÁN CONSTITUIDOS POR UNA CUBIERTA
PROTEICA O CÁPSIDE EN CUYO INTERIOR ESTÁ
CONTENIDO SU MATERIAL GENÉTICO, QUE
PUEDE SER ADN O ARN, DE 5000 A 500 000
PARES DE BASES.
COSMIDOS
• LOS CÓSMIDOS SON VECTORES DE CLONACIÓN, QUE
HAN SIDO AMPLIAMENTE USADOS EN LA ELABORACIÓN
DE GENOTECAS DE ADN GENÓMICOS DE GRAN TAMAÑO,
YA QUE PERMITEN LA INTRODUCCIÓN DE INSERTOS DE
ADN DE HASTA 45 KB, EL DOBLE QUE LOS VECTORES
DERIVADOS DE LA ELIMINACIÓN DE PARTE DEL GENOMA
DEL FAGO Λ, LOS FAGÉMIDOS.

• REALMENTE UN CÓSMIDO CONSISTE EN UN PLÁSMIDO AL

CUAL SE LE HAN ADICIONADO UNOS SEGMENTOS DEL
GENOMA DE UN BACTERIÓFAGO, EL FAGO Λ.
CROMOSOMAS ARTIFICIALES
• LOS CROMOSOMAS ARTIFICIALES HUMANOS,
TAMBIÉN CONOCIDOS POR SU ACRÓNIMO EN INGLÉS
HAC _ HUMAN ARTIFICIAL CHROMOSOME _
SON VECTORES DE TRANSFERENCIA PARA GRANDES
FRAGMENTOS DE ADN. ESTÁN EN DESARROLLO
DESDE LA DÉCADA DE 1990, TRAS EL ÉXITO DE LOS
CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURA YAC Y,
MÁS RECIENTEMENTE, BACTERIANOS BAC Y P1 PAC.
VECTORES DE EXPRESIÓN

• UN VECTOR DE EXPRESIÓN, TAMBIÉN

CONOCIDO COMO CONSTRUCCIÓN DE
EXPRESIÓN, ES NORMALMENTE
UN PLÁSMIDO O VIRUS DISEÑADO PARA LA
EXPRESIÓN GÉNICA EN LAS CÉLULAS.
BACTERIANOS
• UN EJEMPLO DE VECTOR DE EXPRESIÓN
BACTERIANA ES EL PLÁSMIDO PGEX-3X EL
ANFITRIÓN DE EXPRESIÓN DE ELECCIÓN
PARA LA EXPRESIÓN DE MUCHAS
PROTEÍNAS ES ESCHERICHIA COLI COMO
LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA
HETERÓLOGA EN E. COLI ES
RELATIVAMENTE SIMPLE Y CONVENIENTE,
ADEMÁS DE SER RÁPIDA Y BARATA.
VIRALES
• LOS VECTORES VIRALES SON EL MEDIO
MÁS EFICIENTE PARA TRANSFERIR GENES,
PERMITEN MODIFICAR ESPECÍFICAMENTE
A UNA CÉLULA O A UN TEJIDO, PARA
INDUCIR LA EXPRESIÓN DE GENES
TERAPÉUTICOS. ACTUALMENTE, SE
INVESTIGAN DIFERENTES VIRUS QUE
PROPORCIONEN
 HU E SP ED E S D E
CLONACIÓN Y
EXPR E S IÓ N T EM A 5
VENTAJAS

• DEBIDO A QUE LOS HUÉSPEDES DE CLONACIÓN PUEDEN GENERAR UN GRAN NÚMERO DE

COPIAS POR CÉLULA, YA QUE LOS HUÉSPEDES BACTERIANOS O DE LEVADURAS PUEDEN
CRECER INDEFINIDAMENTE EN EL LABORATORIO, ES POSIBLE OBTENER GRANDES
CANTIDADES DE SECUENCIAS DEL ADN DE INTERÉS. CIERTO NÚMERO DE VECTORES SE
UTILIZA DE MODO COMÚN PARA ESTE PROPÓSITO, CADA UNO CON VENTAJAS Y
LIMITACIONES
BACTERIAS
1.ABRIR EL PLÁSMIDO Y "PEGAR" EL GEN DENTRO. ESTE
PROCESO DEPENDE DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (QUE
CORTAN EL ADN) Y DE ADN LIGASA (QUE UNE EL ADN).
2.INSERTAR EL PLÁSMIDO EN LAS BACTERIAS. SE USA
SELECCIÓN CON ANTIBIÓTICOS PARA IDENTIFICAR LAS
BACTERIAS QUE INCORPORARON EL PLÁSMIDO.
3.CULTIVAR BACTERIAS PORTADORAS DE PLÁSMIDO EN
GRAN CANTIDAD Y USARLAS COMO "FÁBRICAS" PARA
PRODUCIR LA PROTEÍNA. RECOLECTAR LA PROTEÍNA DE
LAS BACTERIAS Y PURIFICARLA.
LEVADURAS
• CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICA EN YAC. SE
GENERAN LARGOS FRAGMENTOS DE ADN HUMANO (>500KB)
MEDIANTE DIGESTIÓN PARCIAL CON ECORI DE ADN GENÓMICO
HUMANO. CADA BRAZO DEL VECTOR CONTIENE UN TELÓMERO
EN UN EXTREMO Y UNA PROYECCIÓN DE ECORI-COMPATIBLE
EN EL OTRO. CADA UNO LLEVA, ADEMÁS, UN MARCADOR
DISTINGUIBLE DIFERENTE, Y UN BRAZO CONTIENE TAMBIÉN UN
CENTRÓMERO. LOS BRAZOS DEL VECTOR SE LIGAN A LOS
FRAGMENTOS DE ADN HUMANO PARA GENERAR UN
CROMOSOMA LINEAL ARTIFICIAL CON TELÓMEROS DE
LEVADURA Y MARCADORES DISTINGUIBLES EN CADA EXTREMO
Y UN CENTRÓMERO DE LEVADURAS QUE CONTIENEN YAC
CONSTRUIDO APROPIADAMENTE.
LÍNEAS CELULARES DE MAMÍFEROS E INSECTOS

• LAS CÉLULAS DE MAMÍFERO SON CÉLULAS QUE SE DERIVAN O SE AÍSLAN DEL TEJIDO DE
UN MAMÍFERO. EN ESTE EXPERIMENTO, LOS ESTUDIANTES SE PRESENTAN A CUATRO TIPOS
DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS: FIBROBLASTOS, CÉLULAS EPITELIALES, LINFOCITOS Y
MACRÓFAGOS. LOS LINFOCITOS SE ENCUENTRAN DENTRO DE LA SANGRE. LAS CÉLULAS
EPIDÉRMICAS, LOS FIBROBLASTOS Y LOS MACRÓFAGOS SE ENCUENTRAN DENTRO DE LOS
TEJIDOS.
FIBROBLASTOS
• LOS FIBROBLASTOS SON UN GRUPO
HETEROGÉNEO DE CÉLULAS, TAMBIÉN
DENOMINADAS CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS.
ESTAS SUBPOBLACIONES CELULARES INCLUYEN
LOS “FIBROBLASTOS CLÁSICOS” Y OTROS TIPOS
DE FIBROBLASTOS ESPECIALIZADOS COMO LOS
MIOFIBROBLASTOS, LOS LIPOFIBROBLASTOS, LA
CÉLULA INTERSTICIAL CONTRÁCTIL (CIC) Y LOS
PERICITOS.
CÉLULAS EPITELIALES

• LAS CÉLULAS EPITELIALES SON LAS CÉLULAS

QUE FORMAN EL TEJIDO EPITELIAL, ES DECIR,
EL TEJIDO ORGÁNICO QUE CUBRE LA
SUPERFICIE, TANTO EXTERNA COMO
INTERNA, DE LOS DIFERENTES ÓRGANOS.
FUNCIÓN
• LAS CÉLULAS EPITELIALES ESTÁN ESTRECHAMENTE UNIDAS ENTRE SÍ E INTERACTÚAN ENTRE SÍ
POR MEDIO DE LAS MOLÉCULAS DE ADHESIÓN CELULAR Y LOS SISTEMAS DE UNIONES
ESPECIALIZADAS. PRESENTAN UNA FORMA PAVIMENTOSA, CÚBICA O DE ROMBO QUE LAS
CARACTERIZAN, ASÍ COMO PARA EXPERIMENTAR UNA POLARIDAD MARCADA (ES DECIR, QUE HAN
DE DIVIDIRSE EN DOMINIOS FUNCIONAL Y BIOQUÍMICAMENTE DIFERENTES). LAS CÉLULAS
EPITELIALES SON DE DIFERENTES TAMAÑOS DEPENDIENDO DE LA UBICACIÓN DEL TEJIDO
EPITELIAL. PUEDEN TENER DIFERENTES PAPELES, COMO PROTEGER EL ÓRGANO QUE RECUBREN,
EL AJUSTE DEL INTERCAMBIO DE SUSTANCIAS ENTRE EL ÓRGANO Y EL RESTO DEL ORGANISMO O
INCLUSO LA SECRECIÓN DE SUSTANCIAS COMO HORMONAS, SALIVA, JUGO GÁSTRICO O SUDOR.
CLONACIÓN DE MOLÉCULAS DE DNA
• LA CLONACIÓN MOLECULAR (DE ADN) ES UN
PROCESO QUE USAN LOS CIENTÍFICOS PARA
AMPLIFICAR UNA SECUENCIA CONCRETA DE
ADN (ES DECIR, OBTENER MUCHAS COPIAS DE
ELLA). PARA HACERLO, PRIMERO SE AÍSLA LA
SECUENCIA DIANA; DESPUÉS SE INSERTA ESTE
FRAGMENTO DENTRO DE OTRA MOLÉCULA DE
ADN (CONOCIDA CON EL NOMBRE DE 'VECTOR')
Y, FINALMENTE, SE INTRODUCE EN UNA CÉLULA
HUÉSPED ADECUADA.
AISLAMIENTO TEMA 6
• PARA AISLAR EL DNA CROMOSÓMICO DE GRAN
PESO MOLECULAR ES NECESARIO QUE LAS
PAREDES Y MEMBRANAS CELULARES SE
ROMPAN PREVIAMENTE A UN PROCESO DE
PURIFICACIÓN Y PRECIPITACIÓN DE SUS
ÁCIDOS NUCLEICOS, PARA FINALIZAR CON SU
CUANTIFICACIÓN Y LA DETERMINACIÓN DE SU
NIVEL DE PUREZA.
 • CUANDO ECORI RECONOCE Y CORTA ESTE SITIO, SIEMPRE
GENERACIÓN LO HACE EN UN PATRÓN MUY ESPECÍFICO QUE PRODUCE
EXTREMOS SOBRESALIENTES DE ADN DE CADENA

DE SENCILLA:
• UNA ENZIMA *ECO*RI SE UNE A UN SITIO *ECO*RI EN UN
FRAGMENTOS FRAGMENTO DE ADN Y HACE CORTES EN AMBAS
CADENAS DEL ADN. EL PATRÓN DE CORTE ES:

DE ENZIMAS
DE
RESTRICCIÓN
•  DEESTA MANERA SE PRODUCE UN EXTREMO DE 5'-AATT-3' QUE SOBRESALE EN CADA
EXTREMO DEL ADN CORTADO. SI OTRO FRAGMENTO DE ADN TIENE SECUENCIAS
SOBRESALIENTES COMPLEMENTARIAS (PORQUE TAMBIÉN SE CORTÓ CON ECORI, POR
EJEMPLO), LOS EXTREMOS PUEDEN UNIRSE POR COMPLEMENTARIEDAD DE BASES. POR
ESTA RAZÓN SE DICE QUE LAS ENZIMAS QUE DEJAN EXTREMOS DE CADENA SENCILLA
PRODUCEN EXTREMOS COHESIVOS. LOS EXTREMOS COHESIVOS SON ÚTILES EN LA
CLONACIÓN PORQUE MANTIENEN DOS FRAGMENTOS DE ADN JUNTOS PARA QUE LA ADN
LIGASA LOS PUEDA UNIR.
• NO TODAS LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN PRODUCEN EXTREMOS COHESIVOS. ALGUNAS
PRODUCEN "EXTREMOS ROMOS", CORTES A LA MITAD DE LA SECUENCIA BLANCO QUE NO
DEJAN EXTREMOS DE CADENA SENCILLA. LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN SMAI ES UN
EJEMPLO DE ENZIMA QUE CORTA ASÍ: LA ENZIMA CORTA EN MEDIO DE ESTA SECUENCIA EN
AMBAS CADENAS Y PRODUCE EXTREMOS ROMOS. LOS SITIOS DE CORTE SON:
PREPARACIÓN DEL VECTOR
• CORTE CON LA(S) MISMA(S) ENZIMA(S) DE RESTRICCIÓN CON QUE SE DIGIRIÓ EL INSERTO Y
OBTENER UN ADN LINEAL. LA ESTRATEGIA DE CLONACIÓN DEBE DISEÑARSE PARA QUE EL
CORTE GENERE EXTREMOS CON SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS A LOS EXTREMOS DEL
INSERTO A CLONAR.
• DESFOSFORILACIÓN DEL VECTOR CON LA FINALIDAD DE IMPEDIR LA AUTO LIGACIÓN DEL
VECTOR. SE REALIZA USANDO LA FOSFATASA ALCALINA BOVINA DE ORIGEN INTESTINAL
(CIP) O LA FOSFATASA BACTERIANA (BAP) QUE ELIMINA LOS GRUPOS FOSFATO 5’ DE UNA
CADENA DE ADN.
DESFOSFORILACIÓN
• LA DESFOSFORILACIÓN ES LA ELIMINACIÓN DE
UN GRUPO FOSFATO (PO 4 3− ) DE UN
COMPUESTO ORGÁNICO POR HIDRÓLISIS . ES
UNA MODIFICACIÓN POSTRADUCCIONAL
REVERSIBLE .

• LA DESFOSFORILACIÓN Y SU CONTRAPARTE, LA
FOSFORILACIÓN , ACTIVAN Y DESACTIVAN LAS
ENZIMAS DESPRENDIENDO O UNIENDO
ÉSTERES Y ANHÍDRIDOS FOSFÓRICOS .
ADAPTADORES
• UN ADAPTADOR ES UNA SECUENCIA DE
OLIGONUCLEÓTIDOS DE DOBLE CADENA QUE SE
UTILIZA PARA UNIR DOS MOLÉCULAS DE ADN. ES UNA
SECUENCIA CORTA CON UN EXTREMO ROMO Y UN
EXTREMO PEGAJOSO O COHESIVO. POR LO TANTO,
CONSTA DE UNA COLA MONOCATENARIA EN UN
EXTREMO, LO QUE MEJORA LA EFICIENCIA DE LA
LIGADURA DEL ADN.
LIGACIÓN
• LA LIGACIÓN ES EL ESTABLECIMIENTO DEL
ENLACE FOSFODIESTER DE LAS CADENAS DE
ADN. LA LIGASA CATALIZA EL PROCESO DE
FORMACIÓN DE ESTE ENLACE COVALENTE BAJO
UNAS CONDICIONES DETERMINADAS. ES
UTILIZADA PARA REPARAR CORTES EN CADENAS
DE DOBLE HEBRA. SU BASE BIOLÓGICA SE
ENCUENTRA EN LA UNIÓN DE FRAGMENTOS DE
OKAZAKI DURANTE LA REPLICACIÓN.
TRANSFORMACIÓN
• LA TRANSFORMACIÓN DE PLÁSMIDOS O VECTORES
ES EL PROCESO MEDIANTE EL CUAL EL ADN
EXÓGENO SE TRANSFIERE A LA CÉLULA HUÉSPED.
LA TRANSFORMACIÓN GENERALMENTE IMPLICA LA
ABSORCIÓN DE ADN EN CÉLULAS BACTERIANAS, DE
LEVADURA O VEGETALES, MIENTRAS QUE LA
TRANSFECCIÓN ES UN TÉRMINO GENERALMENTE
RESERVADO PARA LAS CÉLULAS DE MAMÍFEROS. EL
MÉTODO PARA LA TRANSFORMACIÓN DE UNA
CONSTRUCCIÓN DE ADN EN UNA CÉLULA HUÉSPED
ES LA TRANSFORMACIÓN QUÍMICA, LA
ELECTROPORACIÓN O EL BOMBARDEO DE
PARTÍCULAS.
• EN LA TRANSFORMACIÓN QUÍMICA, LAS CÉLULAS SE VUELVEN COMPETENTES (CAPACES DE
ABSORBER ADN EXÓGENO) MEDIANTE EL TRATAMIENTO CON CATIONES DIVALENTES COMO
EL CLORURO DE CALCIO, QUE PRODUCEN LA BACTERIA. PARED CELULAR MÁS PERMEABLE AL
ADN. EL CHOQUE TÉRMICO SE UTILIZA PARA FORMAR TEMPORALMENTE POROS EN LA
MEMBRANA CELULAR, LO QUE PERMITE LA TRANSFERENCIA DEL ADN EXÓGENO A LA
CÉLULA. EN LA ELECTROPORACIÓN, SE USA UN PULSO ELÉCTRICO CORTO PARA HACER QUE
LA CÉLULA BACTERIANA SEA TEMPORALMENTE PERMEABLE. EL BOMBARDEO DE PARTÍCULAS
SE UTILIZA NORMALMENTE PARA LA TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS VEGETALES. LAS
PARTÍCULAS DE ORO O TUNGSTENO SE RECUBREN CON LA CONSTRUCCIÓN DE ADN Y SE
FUERZAN FÍSICAMENTE A LA CÉLULA MEDIANTE UNA PISTOLA DE GENES.
SELECCIÓN DE CLONAS
RECOMBIANTES
• AGENTE DE SELECCIÓN: SON GENES CONTENIDOS
EN LA SECUENCIA DEL VECTOR, LOS CUALES LE
CONFIEREN CARACTERÍSTICAS ADICIONALES AL
SISTEMA DE CLONACIÓN (BACTERIAS, LEVADURAS,
ETC.), QUE PERMITEN LA IDENTIFICACIÓN Y
SELECCIÓN DE LAS CLONAS RECOMBINANTES, ES
DECIR, CLONAS QUE CONTIENEN EL FRAGMENTO
DE DNA DE INTERÉS.
MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CLONAS
 • EL BANCO DE GENES PERMITE
CONSERVAR POR INGENIERÍA GENÉTICA,
LOS GENES DEL ADN DENTRO DEL
MATERIAL GENÉTICO DE BACTERIAS,
ESCOGIENDO EL MATERIAL MÁS
IMPORTANTE DE UN CONJUNTO Y
SUSTITUYÉNDOLO EN LA CADENA DE
MATERIAL GENÉTICO DE DICHA BACTERIA
O VIRUS.

BANCO DE GENES TEMA 7

 • UNA BIBLIOTECA GENÓMICA ES
UNA COLECCIÓN DE BACTERIAS QUE HAN
SIDO GENÉTICAMENTE MODIFICADOS
PARA CONTENER TODO EL ADN DE UN
ORGANISMO. EL TAMAÑO DE LA
BIBLIOTECA VARÍA, DEPENDIENDO DE
CÓMO SE ALMACENA EL ADN DE LAS
BACTERIAS, Y LA LONGITUD DEL GENOMA
DEL ORGANISMO.

BIBLIOTECAS GENOMICAS
 • LOS BANCOS DE ADNC SE CONSTRUYEN A PARTIR DE
SECUENCIAS DE ARNM MEDIANTE UNA REACCIÓN IN
VITRO QUE SINTETIZA UNA PRIMERA CADENA DE ADNC
UTILIZANDO UNA ADN POLIMERASA CON ACTIVIDAD DE
TRANSCRIPTASA INVERSA. EL ARNM QUE NO SE COPIA A
ADNC SE ELIMINA CON LA ADICIÓN DE LA ENZIMA
ARNASA H. LA SEGUNDA CADENA DE ADNC,
COMPLEMENTARIA A LA OBTENIDA DE LA
RETROTRANSCRIPCIÓN, SE SINTETIZA EN UNA REACCIÓN
DE PCR (VÉASE CAPÍTULO DE REACCIÓN EN CADENA DE
LA POLIMERASA) O EMPLEANDO UNA DNAC POLIMERASA
QUE UTILICE LA CADENA SENCILLA DEL ADNC COMO
TEMPLADO.

GENOTECAS DE CDNA
GENOTECAS DE ADNG
• PARA CONSTRUIR BANCOS DE ADN ES NECESARIO AISLAR EL ADNG DEL ORGANISMO DE
INTERÉS. ESTE ADNG SE CORTA CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN PARA GENERAR
FRAGMENTOS CON EXTREMOS COMPLEMENTARIOS A LOS DEL VECTOR DE CLONACIÓN.
UNA VEZ QUE SE HA CONSTRUIDO LA GENOTECA, SE RASTREA EL CLON O CLONES QUE
PORTAN EL ADN CON EL GEN DE INTERÉS. LOS MÉTODOS MÁS FRECUENTES DE
IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES EN UNA GENOTECA SON LA HIBRIDACIÓN
USANDO ALGUNA SONDA MARCADA (VÉASE CAPÍTULO DE TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN), EL
USO DE ANTICUERPOS FRENTE A LA PROTEÍNA DE INTERÉS O LA SELECCIÓN DE CLONAS
POR LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LA PROTEÍNA.
 • BIBLIOTECA DE CDNA DEBE CONTENER
CLONES SUFICIENTES DE MRNA.
HIBRIDACIÓN CON SONDAS DE DNA O RNA
MARCADAS RADIOACTIVAMENTE. LA
MEMBRANA SE SECA Y A SU SUPERFICIE
SE FIJA EL ADN RECOMBINANTE. POR
ULTIMO LA MEMBRANA SE INCUBA CON
UNA SONDA CON MARCA RADIACTIVA EN
CONDICIONES DE HIBRIDACIÓN.

BIBLIOTECAS DE ADNC
• ESTA SE CONSTRUYE A PARTIR DE MRNA DE
UN TIPO PARTICULAR DE CÉLULA, SE PRODUCE
CDNA UTILIZANDO TRANSCRIPTASA INVERSA
LA CUAL PRODUCE DNA DE UNA BANDA QUE
VA A CONVERTIRSE EN DNA DE DOS BANDAS
CON LA ENZIMA DNA POLIMERASA I. ESTE
DNA SE SOMETE EN FORMA ADECUADA A LA
REACCIÓN DE TRANSFERENCIA TERMINAL Y
LUEGO EL DNA RESULTANTE SE CLONA.
 • LAS BIBLIOTECAS DE EXPRESIÓN SON
MUY SIMILARES A LAS BIBLIOTECAS MÁS
TRADICIONALES PERO EN LUGAR DE LA
DETECCIÓN DE ADN DE INTERÉS, LAS
BACTERIAS TRANSCRIBEN Y TRADUCEN
YFP Y UTILIZA UNA SONDA DE
ANTICUERPO PARA ENCONTRAR LA
COLONIA DE CÉLULAS QUE HAN
EXPRESADO YFP. 

BIBLIOTECAS DE EXPRESIÓN
TAM IZ A J E D E BA NC OS D E
GENES
TEMA 8
GENERALIDADES DE SONDAS

• LAS SONDAS SON UNA SECUENCIA DE ADN O ARN DE CADENA SIMPLE QUE SE UTILIZA PARA ENCONTRAR
SU SECUENCIA COMPLEMENTARIA EN EL GENOMA DE UNA MUESTRA.
TIPOS DE SONDA
ADN
Las sondas de ADN se generan de 3
maneras:
1. Por vectores de clonación, donde los
clones tienen una porción de ADN de un
organismo determinado.
2. Amplificación de secuencias específicas
de ADN por PCR.
3. A partir de ADN genómico aislado del
núcleo de un organismo; estas sondas se
utilizan en investigación viral, bacteriana o
genómica
ARN
Estas sondas se obtienen mediante un
proceso de transcripción in vitro a partir
de
un ADN molde linear que incorpora
nucleótidos marcados.
 Son de una sola hebra y susceptibles a
la
degradación por acción de ARNsas.
 Las sondas ARN tienen la ventaja de
tener
híbridos ARN-ARN más estables que los
ADN-ADN o los ADN-ARN.
TIPOS DE MARCADORES
ISOTOPOS RADIACTIVOS FLUORCROMOS NO ISOTÓNICAS
Los radioisótopos tienen Son compuestos químicos Ofrecen una estabilidad en
la foto reactivos que el marcaje de sondas, dan
propiedad emitir energía absorben energía de la luz resultados rápidos y de
en forma de radiación a determinada longitud de mejor resolución.
ionizante al buscar una onda y emiten esa luz a
configuración estable. Son una longitud de onda más
radioactivos por núcleo alta.
inestable.
TÉCNICAS DE MARCAJE

• SE UTILIZAN VARIOS MÉTODOS DE MARCAJE PARA DISTRIBUIRLO POR TODA LA SONDA, COMO LA PCR
CON DESOXINUCLEÓTIDOS (DNTP) O TRIFOSFATOS DE NUCLEÓTIDOS (NTP) MARCADOS, CEBADO
ALEATORIO Y DESPLAZAMIENTO DE MELLAS. EL MARCAJE TERMINAL ES PARTICULARMENTE ÚTIL PARA
INVESTIGAR LAS INTERACCIONES ENTRE ÁCIDOS NUCLEICOS Y PROTEÍNAS CON EL FIN DE EVITAR EL
IMPEDIMENTO ESTÉRICO.
MARCAJE DE AC
MÉTODOS DE BÚSQUEDA MOLÉCULAS
• HIBRIDACIÓN

• EN ESTE MÉTODO AL BUFFER DE PREHIBRIDIZACIÓN SE LE ADICIONA LA SONDA

MARCADA Y SE INCUBAN LAS LÁMINAS EN CÁMARA HÚMEDAS.

• PARA OBTENER UN ACOPLAMIENTO ÓPTIMO ENTRE LA SONDA Y LA DIANA SE PRECISAN ALREDEDOR DE

UNA A DOS HORAS PARA SONDAS BIOTINILADAS O CONJUGADAS CON FLUOROCROMOS Y HASTA DOCE
HORAS PARA SONDAS CONJUGADAS CON DIGOXIGENINA.
SOUTHERM BLOT
• ES UN MÉTODO DE LABORATORIO QUE SE UTILIZA PARA ESTUDIAR EL ADN.
• EL ADN PURIFICADO PROVENIENTE DE UNA MUESTRA BIOLÓGICA (COMO SANGRE O TEJIDO) SE DIGIERE
MEDIANTE UNA ENZIMA DE RESTRICCIÓN, Y LOS FRAGMENTOS DE ADN RESULTANTES SE SEPARAN MEDIANTE
CORRIENTE ELÉCTRICA PARA HACERLOS DESPLAZAR A TRAVÉS DE UN GEL O MATRIZ SIMILAR A UN TAMIZ, QUE
PERMITE QUE LOS FRAGMENTOS MÁS PEQUEÑOS SE DESPLACEN MÁS RÁPIDO QUE LOS FRAGMENTOS MÁS
GRANDES.

• LOS FRAGMENTOS DE ADN SE TRANSFIEREN FUERA DEL GEL O DE LA MATRIZ A UNA MEMBRANA SÓLIDA, QUE
LUEGO SE EXPONE A UNA SONDA DE ADN MARCADA CON UNA SUSTANCIA RADIOACTIVA, FLUORESCENTE O
QUÍMICA. LA MARCACIÓN PERMITE QUE LOS FRAGMENTOS DE ADN QUE CONTIENEN SECUENCIAS
COMPLEMENTARIAS A LA SECUENCIA DE ADN UTILIZADA COMO SONDA SEAN VISUALIZADOS EN EL SOUTHERN
BLOT.
NORTHERM BLOT
• ES UN MÉTODO DE ANÁLISIS DE LABORATORIO QUE SE UTILIZA PARA ESTUDIAR EL ARN.
• LOS FRAGMENTOS DE ARN PURIFICADOS PROVENIENTES DE UNA MUESTRA BIOLÓGICA (COMO SANGRE O TEJIDO) SE
SEPARAN MEDIANTE CORRIENTE ELÉCTRICA PARA HACERLOS DESPLAZAR A TRAVÉS DE UN GEL O MATRIZ SIMILAR A UN
TAMIZ, QUE PERMITE QUE LOS FRAGMENTOS MÁS PEQUEÑOS SE DESPLACEN MÁS RÁPIDO QUE LOS FRAGMENTOS MÁS
GRANDES.

• LOS FRAGMENTOS DE ARN SE TRANSFIEREN FUERA DEL GEL O DE LA MATRIZ A UNA MEMBRANA SÓLIDA, QUE LUEGO SE
EXPONE A UNA SONDA DE ADN MARCADA CON UNA SUSTANCIA RADIOACTIVA, FLUORESCENTE O QUÍMICA.

• LA MARCACIÓN PERMITE QUE LOS FRAGMENTOS DE ARN QUE CONTIENEN SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS A LA
SECUENCIA DE ADN UTILIZADA COMO SONDA SEAN VISUALIZADOS EN EL NORTHERN BLOT.
WESTERN BLOT
• ES UNA TÉCNICA DE LABORATORIO UTILIZADO PARA DETECTAR UNA PROTEÍNA ESPECÍFICA EN UNA MUESTRA DE SANGRE O
TEJIDO.

• EL MÉTODO IMPLICA EL USO DE ELECTROFORESIS EN GEL PARA SEPARAR LAS

PROTEÍNAS DE LA MUESTRA. LAS PROTEÍNAS SEPARADAS SE TRANSFIEREN DEL GEL A LA SUPERFICIE DE UNA MEMBRANA.

• LA MEMBRANA SE EXPONE A UN ANTICUERPO ESPECÍFICO CONTRA LA

PROTEÍNA EN ESTUDIO.

• LA UNIÓN DEL ANTICUERPO SE DETECTA USANDO UN MARCADOR RADIACTIVO O

QUÍMICO. UN WESTERN BLOT SE UTILIZA A VECES PARA DIAGNOSTICAR
ENFERMEDADES.
TECNOLOGÍAS PARA EL
ESTUDIO TEMA 9
REACCIÓN EN CADENA DE LA DNA POLIMERASA

• LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ES UNA TÉCNICA DE LABORATORIO QUE PERMITE LA

PRODUCCIÓN (AMPLIFICACIÓN) RÁPIDA DE MILLONES A MILES DE MILLONES DE UN SEGMENTO
ESPECÍFICO DE ADN, QUE ASÍ SE PODRÁ ESTUDIAR EN MAYOR DETALLE.

• LA PCR IMPLICA EL USO DE FRAGMENTOS CORTOS DE ADN SINTÉTICO, DENOMINADOS CEBADORES, PARA
SELECCIONAR UN SEGMENTO DEL GENOMA QUE SE AMPLIFICARÁ, Y LUEGO MÚLTIPLES SESIONES DE
SÍNTESIS DE ADN PARA AMPLIFICAR ESE SEGMENTO.
PASOS
• 1. DESNATURALIZACIÓN (96°C):

LA REACCIÓN SE CALIENTA BASTANTE PARA SEPARAR, O DESNATURALIZAR, LAS CADENAS DE ADN. ESTO PROPORCIONA LOS MOLDES DE CADENA
SENCILLA PARA EL SIGUIENTE PASO.
2. TEMPLADO (55 -65°C):

LA REACCIÓN SE ENFRÍA PARA QUE LOS CEBADORES PUEDAN UNIRSE A SUS SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS EN EL MOLDE DE ADN DE CADENA SENCILLA.
3. EXTENSIÓN (72°C):

LA TEMPERATURA DE LA REACCIÓN SE ELEVA PARA QUE LA TAQ POLIMERASA EXTIENDA LOS CEBADORES Y SINTETICE ASÍ NUEVAS CADENAS DE ADN.
TIPOS DE PCR

• MÚLTIPLE
• ESTE TIPO DE PCR SE REFIERE AL USO DE REACCIÓN DE CADENA DE LA POLIMERASA PARA AMPLIFICAR
VARIAS SECUENCIAS DE ADN DIFERENTES SIMULTÁNEAMENTE. ESTE PROCESO AMPLIFICA ADN EN LAS
MUESTRAS QUE UTILIZAN MÚLTIPLES PRIMERS Y UNA ADN POLIMERASA MEDIADA POR TEMPERATURA EN
UN TERMOCILADOR.
EN TIEMPO REAL

• LA PCR EN TIEMPO REAL ES UNA MODALIDAD DEL PCR DE PUNTO FINAL, DONDE LA ACUMULACIÓN DE ADN
AMPLIFICADO ES DETECTADO Y CUANTIFICADO A MEDIDA QUE LA REACCIÓN AVANZA, ES DECIR: “EN
TIEMPO REAL” ESTO SE LOGRA INCORPORANDO UNA MOLÉCULA FLUORESCENTE QUE SE ASOCIA AL ADN
AMPLIFICADO, DONDE EL INCREMENTO DE ESTA FLUORESCENCIA ES LA PROPORCIONAL AL INCREMENTO
DE LA CANTIDAD DE MOLÉCULAS DE ADN AMPLIFICADAS EN LA REACCIÓN.
• EN LA RT-PCR, SE RETROTRANSCRIBE UNA HEBRA O CADENA O BANDA DE ARN EN ADN COMPLEMENTARIO
(ADNC) USANDO UNA ENZIMA LLAMADA TRANSCRIPTASA INVERSA O TRANSCRIPTASA REVERSA, Y EL
RESULTADO SE AMPLIFICA MEDIANTE UNA PCR TRADICIONAL.

• LA AMPLIFICACIÓN EXPONENCIAL MEDIANTE PCR EN TRANSCRIPCIÓN REVERSA SUPONE UNA TÉCNICA

ALTAMENTE SENSIBLE, QUE PUEDE DETECTAR UN NÚMERO DE COPIAS DE ARN MUY BAJO.
MICROARREGLOS
• LOS MICROARREGLOS SON EN LA ACTUALIDAD UNA PODEROSA HERRAMIENTA DE ANÁLISIS DE
EXPRESIÓN DE GENES DEBIDO AL MAYOR NÚMERO DE SECUENCIAS QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR
PRUEBA Y TIENEN GRANDES VENTAJAS SOBRE OTRAS TÉCNICAS COMO LA PCR CONVENCIONAL, LA RT-
PCR Y LA PCR EN TIEMPO REAL, EN LAS CUALES SÓLO SE PUEDEN ANALIZAR UN NÚMERO MUY LIMITADO DE
GENES DE MANERA SIMULTÁNEA, DEBIDO A QUE EN LA MAYORÍA DE LOS CASOS QUE SE REQUIERE
MONTAR UN ENSAYO POR CADA GEN A ANALIZA.
RFLPS

• LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN DE LONGITUD POLIMORFICA (RFLPS) SON UN TIPO DE

POLIMORFISMO QUE RESULTA DE LA VARIACIÓN EN LA SECUENCIA DE ADN RECONOCIDA POR LAS
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. ESTAS SON ENZIMAS BACTERIANAS QUE UTILIZAN LOS CIENTÍFICOS PARA
CORTAR MOLÉCULAS DE ADN EN LUGARES CONOCIDOS. LOS RFLPS (SE PRONUNCIA "RIF LIPS") Y QUE SE
UTILIZAN COMO MARCADORES EN LOS MAPAS GENÉTICOS. POR LO GENERAL, PARA VISUALIZAR LOS
RFLPS SE UTILIZA LA ELECTROFORESIS EN GEL.
REFERENCIAS
• SANDOVAL RODRÍGUEZ M ;MENA ENRÍQUEZ A. (2009). VECTORES DE
CLONACIÓN Y EXPRESIÓN. AGOSTO 22, DE ACCESS MEDICINA SITIO WEB:
HTTPS://ACCESSMEDICINA.MHMEDICAL.COM/CONTENT.ASPX?BOOKID=1
473§IONID=102743892

• METZENBERG, S. (2008). ENZIMAS DE RESTRCCION. 22 AGOSTO, DE KHAN

ACADEMY SITIO WEB:
HTTPS://ES.KHANACADEMY.ORG/SCIENCE/BIOLOGY/BIOTECH-DNATECHNOLOGY/DNA-CLONING-TUTORIAL
/A/RESTRICTION-ENZYMES-DNALIGASE