1. RESUMEN.
Un medio de cultivo es aquel que se
encuentra enriquecido con diferentes
sustancias químicas como azucares,
carbono, extractos de carne o sangre.
En este trabajo el medio de cultivo se
diseñó selectivamente para levaduras,
entre los ingredientes del medio
casero realizado se encuentra papa,
agar vegetal, azúcar y gentamicina
como adictivo para volver selectivo el
medio, como fuente de levaduras
silvestres se usó fermento de piña con
azúcar la cual se dejó en fermentación
cinco días antes de la realización del
sembrado en el medio, al final para la
evaluación de las levaduras se utilizó
un frotis con tinción de Gram, para ser
observados al microscopio y poder ver
su morfología para su posterior
identificación, con ayuda de la
literatura y de acuerdo a su morfología
se pudo identificar como un tipo de
levadura llamada Brettanomyces
(Dekkera bruxellensis).
Palabras claves: Medio, casero,
selectivo, levaduras, Brettanomyces
2. ABSTRACT.
A culture medium is one that is
enriched with different chemical
substances such as sugars, carbon,
extracts of meat or blood. In this work,
the culture medium was selectively
designed for yeast, among the
ingredients of the home environment,
there is potato, vegetable agar, sugar
and gentamicin as addictive to make
the medium selective, as a source of
wild yeast pineapple ferment with
sugar was used which was left in
fermentation five days before the
realization of the seeding in the middle,
at the end for the evolution of the
yeasts a smear with Gram stain was
used, to be observed under the
microscope and to be able to see its
morphology for its later identification,
with the help of literature and
according to its morphology it could be
identified as a type of yeast called
Brettanomyces (Dekkera
bruxellensis). Keywords: Middle, home,
selective, yeasts, Brettanomyces
3. INTRODUCCIÓN.
Uno de los sistemas más importantes
para la identificación de
microorganismos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en
el que crecen los microorganismos es
el Medio de Cultivo y el crecimiento de
los microorganismos es el Cultivo. Se
han preparado más de 10.000 medios
de cultivo diferentes. Para que los
microorganismos crezcan
adecuadamente en un medio de
cultivo artificial debe reunir una serie
de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuadas, así
como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo
contaminante 1.
La base de muchos medios de cultivo
es una infusión de extractos de carne
y Peptona a la que se añadirán otros
ingredientes, otros organismos no
necesitan los extractos antes
mencionados, sino que solo necesitan
extractos ricos en azucares y otras
sustancias químicas, estos
organismos son en su mayoría
hongos, en especial levaduras. El agar
es un elemento solidificarte muy
empleado para la preparación de
medios de cultivo. Se licúa
completamente a la temperatura del
agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 40 grados, con mínimas
excepciones no tiene efecto sobre el
crecimiento de las bacterias y no es
atacado por aquellas que crecen en él,
la gelatina es otro agente solidificante,
pero se emplea mucho menos ya que
bastantes bacterias provocan su
licuación 2.
En los diferentes medios de cultivo se
encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de
carbono, suero, sangre completa, bilis,
etc. Los hidratos de carbono se
adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para
detectar reacciones de fermentación
de los microorganismos que ayuden a
identificarlos. El suero y la sangre
completa se añaden para promover el
crecimiento de los microorganismos
menos resistentes. También se
añaden colorantes que actúan como
indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como
inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol
se usa como indicador ya que es rojo
en pH básico y amarillo en pH ácido.
La Violeta de Genciana se usa como
inhibidor ya que impide el crecimiento
de la mayoría de las bacterias Gram-
positivas) 3. En este trabajo el medio
que se utilizará será selectivo para
levaduras, esto se logrará con la
adición de un antibiótico.
La levadura es todo aquel organismo
de tipo eucariota y son clasificados
como hongos de vida microscópica
conformados por un solo tipo de
células (unicelulares), estos son
importantes en el proceso de
descomposición de toda materia
orgánica bajo el uso del proceso
conocido como fermentación, los
principales compuestos que son
víctimas de este proceso son los
carbohidratos y sus diversos tipos de
azúcares, de acuerdo al compuesto
que descomponga se obtendrá un
producto diferente 4.
Las levaduras pertenecen a dos
clases de hongos: Ascomicetos o
Basidiomicetos, aunque muchas de
ellas se presentan comúnmente en la
forma imperfecta. Las levaduras
Ascomicéticas forman ascas libres,
con 1 a 8 ascosporas, y en las
especies hifales las ascas están
desnudas. Las ascoporas de las
levaduras son algo más resistentes al
calor y la desecación que las células
vegetativas, si bien tienen mucha
menor resistencia térmica que las
esporas bacterianas, por lo que
mantienen la viabilidad de la especie
durante los cambios adversos del
medio ambiente 5.
Las levaduras son organismos
aerobios y aunque muchas especies
son fermentadoras, otras no lo son,
como los géneros Cryptococcus y
Rhodotorula. Las levaduras suelen
fermentar unos pocos glúcidos,
principalmente hexosas y disacáridos.
El género Saccharomyces y unos
pocos más, son fermentadores
enérgicos de los azúcares bajo
condiciones anaeróbicas. Dekkera, su
anamorfo Brettanomyces y algunas
otras, fermentan glucosa más rápido
en aerobiosis 6.
El objetivo de este trabajo es realizar
un medio de cultivo casero que sea
selectivo para levaduras, para usarse
posteriormente para sembrar
levaduras que se obtendrán de
extractos de jugo fermentado de
frutas, en este caso piña.
4. MATERIALES Y MÉTODOS.
Como materia prima se utilizó papa
(Solanum tuberosum) de la variedad
local, azúcar de mesa, Gentamicina
inyectable de 80 mg como antibiótico
selectivo y agar vegetal de la marca
Rincón Natural®.
4.1 Preparación del medio de cultivo.
Se hirvieron 4 papas previamente
peladas en 1.5 L de agua purificada
durante 30 minutos, se resguardo el
agua con extracto de papa en un
recipiente y las papas hervidas en otro
recipiente.
Se vertieron 150 ml de agua con
extracto de papa añadiendo 5 trozos
pequeños de papa hervida en una
licuadora y se licuó por 3 minutos a
velocidad constante seguidamente se
filtró el líquido con ayuda de una gasa
y se depositó en un vaso de
precipitado diluyendo una cucharada
de azúcar y tapando con papel
aluminio para evitar contaminación.
Se calentaron 100 ml de agua
purificada hasta ebullición y se
agregaron 16 g del Agar vegetal
mientras se agitaba manualmente en
un matraz Erlenmeyer hasta diluir por
completo calentando la mezcla por 30
segundos en microondas para ayudar
a la homogenización y se añadió al
matraz el jugo de papa filtrado.
Seguidamente se esterilizo el medio
en autoclave a una temperatura de
120°C por 15 minutos, esto para evitar
cualquier tipo de contaminación en el
medio, al terminar se dejó enfriar el
medio hasta una temperatura de 45°C.
Se trasladó el medio a una campana
de flujo laminar previamente
esterilizada con alcohol, con ayuda de
una jeringa se le introdujo 0.7 ml de
Gentamicina de 80 mg agitando el
medio de manera leve, seguidamente
se vertió el medio de cultivo en 5 cajas
Petri de plástico cuidando la cantidad
de medio por caja.
Las cajas con el medio de cultivo ya
cuajado se sellaron con cinta adhesiva
y se resguardaron en un incubador a
37°C por 24 horas como prueba de
esterilidad, pasado el tiempo se
revisaron las cajas para observar si
existía crecimiento bacteriano.
4.2 Siembra de levaduras en medio
de cultivo.
5 días antes de la preparación del
medio de cultivo se colocaron
cascaras de piña con azúcar en un
recipiente sellado para que ocurriera
una fermentación alcohólica con
presencia de levaduras.
Al completar la prueba de esterilidad,
se llevaron a campana de flujo laminar
las cajas Petri con el medio de papa y
el fermento de piña donde con ayuda
de un aza se sembraron las levaduras
en el medio con la técnica del
pentágono.
Al finalizar la siembra de las levaduras
se dejaron reposar por 24 horas en
una incubadora a temperatura
ambiente para el crecimiento de las
levaduras, transcurrido ese tiempo se
sellaron y se refrigeraron por 72 horas.
4.3 Observación de frotis de
levaduras en microscopio.
Las cajas Petri se abrieron en
campana de flujo laminar y con ayuda
de un aza previamente esterilizada en
un esterilizador de perlas se dio un
ligero roce a una colonia de levaduras
de poca población haciendo esto por
triplicado, colocando la levadura
obtenida en una gota de solución
salina previamente colocada en un
portaobjetos, la metodología se repite,
pero tomando levaduras de colonias
con mayor proliferación.
Posteriormente con ayuda de un
mechero de bunsen se sellaron las
muestras de levaduras y se tiñeron
con Gram, se dejaron secar a
temperatura ambiente y se observaron
las levaduras en microscopio óptico.
5. RESULTADOS.
5.1 Medios de cultivo.
El análisis de los 5 medios de cultivos
obtenidos como producto permitieron
constatar el correcto empleo de la
metodología para su elaboración, se
obtuvieron medios sólidos selectivos,
libres de contaminación bacteriana.
(Figura1)

Figura 2. Crecimiento proliferado de Levaduras

producto de la fermentación alcohólica de
Cascara de Piña y azúcar.
Figura 1. Medio de cultivo selectivo de Agar
Natural y Papa.
5.3 Observación de Frotis de
5.2 Siembra de levaduras en Medio levadura en el Microscopio.
de Cultivo.
En la primera vista bajo el microscopio
Pasado el tiempo de la prueba de respecto al cultivo de levaduras
esterilidad del medio, y resultando Brettanomyces aka, como era de
este sin ningún agente bacteriano, se esperarse, se observaron minúsculas
realizó la siembra de levaduras, de la figuras, sin contaminación con otros
cual se pudo observar el crecimiento microorganismos, esto se puede
proliferado de estos microorganismos. constatar en las figuras 3 y 4.
Montes Díaz 2003, menciona al
respecto: que la mayoría de las
colonias jóvenes de levaduras son
húmedas algo mucosas, aunque es
posible que tengan aspecto harinoso.
Algunas colonias tienen un color
crema o rosado1, las colonias aisladas Figura 3. Brettanomyces como diminutas
presentaron el color característico de formas alargadas
blanco lechoso, forma circular,
superficie ovalada (Figura 2), lo cual
nos muestra que los resultados
obtenidos concuerdan con la teoría.

Figura 4. Avistamiento de Minúsculas

Levaduras 4x
Se realizaron varios avistamientos de
morfología microscópica como se
observan a continuación:
Figura 5. Morfología de cultivo de levaduras
Brettanomyces frotis número 1, visto a 100x
Figura 6. Morfología de cultivo de
levaduras, Brettanomyces frotis 2 visto a
100X
Figura 7. En la figura se observa el frotis
número 3, visto a 40X
Figura 8. En la figura se observan las
levaduras del frotis 2 visto a 100X
Figura 9. En la figura el inciso A muestra la
morfología de las levaduras aisladas de la
piña y en el inciso B se observa levaduras
Brettanomyces obtenidas durante un estudio
hecho a los vinos tintos para la identificación
de las levaduras. 13
6. Discusión.
Al efectuar esta práctica pudimos
observar que uno de los pilares para la
correcta elaboración de un medio de
cultivo para levaduras, es la
estimación exacta del uso de Agar
Natural, como se relata en una
investigación realizada, se utiliza
como agente gelificante para dar
solidez a los medios de cultivo, es una
sustancia inerte polisacárida que se
extrae de las algas, por lo tanto,
aplicar la porción necesaria influye en
la calidad de solidez del medio. 7
Otro paso determinante es la adición
de determinadas sustancias a un
medio de cultivo a fin de volverlas
Selectivas tal como menciona Yaniris
Lorenzo Acosta y Ma Cristina Obaya
Abreu en su trabajo “Control de
calidad de los medios de cultivo
utilizados en Levaduras” quienes
explican que los medios selectivos
son aquellos que permiten el
crecimiento de un tipo de
microorganismos determinado,
inhibiendo el desarrollo de los demás
y esto se logra con sustancias como el
cristal violeta, sales biliares, azida
sódica, telurito potásico, antibióticos,
etc., en este caso se hizo empleo del
antibiótico denominado Gentamicina.8
De igual manera gracias una
investigación realizada pudimos
constatar la importancia del uso de la
Papa donde se nos menciona que la
infusión de está promueve un
crecimiento abundante de los hongos
y levaduras, como fuente de almidón.
Las levaduras más comunes que
pueden crecer son la Candida
albicans, Brettanomyces (Dekkera
bruxellensis). y Saccharomyces
Cerevisiae y hongos tales como
Aspergillus Níger. 9
Es interesante el medio que se
preparó para que la levadura tenga
una actividad metabólica se
adecuaron las características del
medio en favor del microorganismo, tal
es el caso de la temperatura al
mantener el medio a 37° C
(Temperatura ambiente) esto cobra
sentido con la literatura en el trabajo
de Suarez- Machín, Caridad Garrido –
Carralero “Crecimiento de la Levadura
Saccharomyces Cerevisiae y ningún agente bacteriano y la
Brettanomyces (Dekkera
bruxellensis).” 10
Déak y Beuchat 1996, menciona que
la vasta mayoría de las levaduras son
mesófilas, con una temperatura
máxima de crecimiento entre 24 y
48ºC. 11
Fernández Vila 2005, menciona que
las levaduras son comunes en las
hojas de las plantas, en los frutos y en
las flores, también se encuentran en la
superficie de la piel y en el tracto
intestinal de los animales de sangre
caliente donde pueden vivir en
simbiosis o como parásitos. También
se encuentran en los suelos y en el
agua salada donde contribuyen a la
descomposición de plantas y algas,
para el asilamiento se utilizó cascaras
de Piña, lo cual nos indica por teória
que existe crecimiento de levaduras
tal como se dio en la práctica. 12
Con esta serie de explicaciones nos
damos cuenta, por que el experimento
fue todo un éxito y se pudieron obtener
los resultados deseados que era,
crear un medio de cultivo casero que
permita el crecimiento, la proliferación
de las levaduras.
7. Conclusión.
Podemos concluir que el objetivo
principal de la elaboración de un
medio casero a base de papa para
levaduras se cumplió de manera
exitosa debido a que la metodología
presentada fue eficaz ya que pudo
librar las pruebas tanto de esterilidad
como el crecimiento de levaduras sin
observación de levaduras en el
microscopio nos reafirma que el medio
elaborado resulto de una alta calidad
para usarse en laboratorios tanto
escolares como profesionales.
8. Agradecimientos.
Agradecemos al Instituto Tecnológico
Superior de Calkiní (ITESCAM) por
facilitarnos el uso del laboratorio de
biotecnología y también al Dr. Iván
Alfredo Estrada Mota por compartir
sus conocimientos de manera cálida y
amigable para guiarnos en este
trabajo de laboratorio.
9. Fuentes de Consulta
1. Krikorian, A. D. (1991). Medios de
cultivo: generalidades, composición y
preparación. Cultivo de tejidos en la
agricultura: fundamentos y Temperatura
aplicaciones. Cali: CIAT, 41-77.
2. Herrera Guirola, A. L.
(1985). Manual de medios de cultivo.
Ministerio de Cultura, La Habana
(Cuba)..
3. Merck, E. (1985). Manual de medios
de cultivo Merck (No. 01-A1 LU. AL-
McAl. 2.). E. Merck.
9. González, A., & Valenzuela, L.
(2000). Saccharomyces cerevisiae.
10. M achín, C. S., Carralero, N. A. G.,
& Amarilys, C. LEVADURA
SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y
SU CRECIMIENTO EN MEDIOS DE
CULTIVO. Revisión A Review.
11. Deak, T., & Beuchat, L. R. (1996).
para medios de
Cultivo.61-95.
12. Fernández Vila (2005).
Fermentación alcohólica: Una opción
para la producción de energía
renovable a partir de desechos
agrícolas. Ingeniería, investigación y
tecnología, 8(4), 249-259.

4. Mueller GM et al. 2004. Biodiversity 13. Montez Diaz, (2003). Identificación

of Fungi. Elsevier, Amsterdam, p 595. de levaduras.

5. Carlile MJ et al. 2001. The Fungi. 2ª

ed. Academic Press, San Diego, p 70.

6. Déak T, Beuchat LR. 1996.

Handbook of Food Spoilage Yeasts.
CRC Press, Boca Ratón, cap 7

7. Mejía, G. I., Guzmán, A., Agudelo,

C. A., Trujillo, H., & Robledo, J. (2004).
Cinco años de experiencia con el agar
de papa para la levadura y
hongos. Biomédica, 24, 52-59.

8. Acosta, Y. L., & Abreu, M. C. O.

Instituto Cubano de Investigaciones
de los medios de cultivo y sus
derivados (ICIDCA) e. mail:
yaniris.lorenzo@icidca.edu. Cu
cristina. obaya@ icidca. edu. cu.