Preparación, Esterilización y Prueba de Esterilidad para Agar Mueller Hinton Méndez, Helena – Palacios, Hasleidy Universidad de Boyacá – Facultad

Ciencias de la Salud – Bacteriología y Laboratorio Clínico RESUMEN En condiciones de laboratorio se realizó la preparación de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparación dadas por la casa comercial. Basados en esta información se realizaron los cálculos adecuados para la preparación de 20ml de Agar Mueller Hinton, que serian distribuidos en dos cajas de petri pequeñas. Inicialmente se pesaron 1.86 gr. del agar (en polvo) incluido el peso del papel, necesarios para la preparación del medio de cultivo. Seguidamente se diluyo la cantidad del medio de cultivo en un vaso de precipitado que contenía 20 ml de agua destilada, y se calentó a 250ºC hasta que hirviera; una vez obtenida la preparación, se llevo a esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Luego se procedió a distribuir en las dos cajas de petri el medio de cultivo (aproximadamente 10 ml en cada una) utilizando la cámara de flujo laminar, para evitar la contaminación de este. Finalmente se realizo la prueba de esterilidad, incubando los medios de cultivos preparados durante 24 horas con una temperatura de 37ºC. Las observaciones posteriores al periodo de tiempo requerido para la incubación del medio de cultivo, arrojaron resultados negativos para el crecimiento de colonias, indicando que el método de esterilización empleado es efectivo, y que el medio de cultivo puede ser utilizado para el aislamiento de diferentes microorganismos. PALABRAS CLAVE: Agar Mueller Hinton, esterilización, medios de cultivo, prueba de esterilidad. INTRODUCCIÓN Fue en 1876 cuando Koch fue capaz de propagar una bacteria patógena (Bacillus anthracis) en cultivo puro, fuera del cuerpo que la portaba; en 1881, utilizando un medio liquido, lo solidifico con gelatina y desarrollo los métodos de rayado y siembra en placa para aislamiento de bacterias. El siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, al utilizar como agente solidificante un producto denominado agar, extraído de las algas rojas. El agar era muy superior a la gelatina, ya que era resistente a la digestión microbiana y a la licuefacción. Se enriqueció la composición de los cultivos solidificados utilizando extractos de carne e infusiones, a fin de equipararlos con el tejido infectado portador (1). Para el aislamiento, estudio y clasificación de los microorganismos, es necesario utilizar un medio de cultivo en el que se dispongan de las sustancias orgánicas e inorgánicas necesarias e indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los microorganismos además de poder multiplicarse, pueden manifestar características de crecimiento y propiedades bioquímicas, aspectos de gran importancia para su clasificación. (2). Estos preparado, poseen

semisólidos: presentan agar en su composición pero en una proporción . calentándolo y agitándolo al mismo tiempo. según las características de crecimiento.Medios de uso general: son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos. el agar. permite el aislamiento de un microorganismo a partir de un sustrato natural (suelo.empíricos: en su composición aparecen sustancias orgánicas. propiedades tintoriales y reacciones bioquímicas. en una proporción de 12 a 15 gramos por litro. pus. etc. tener un pH adecuado. . Ventajas al Utilizar los Medios de Cultivo. el microorganismo que se busca. . y estar esterilizados. hasta su completa disolución.). . agua. morfología celular.medios enriquecidos: suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores. etc. Según el uso a que se destinen: . azucares e indicadores. antitoxinas. se disuelven 38g en un litro de agua destilada.Medios selectivos: además de contar en su composición con los mismos productos que los medios diferenciales. concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida. El matraz se cierra con doble capa de papel aluminio. permite la identificación del microorganismo. plantas. minerales y vitaminas.Medios diferenciales: contienen colorantes.Sólidos: presentan en su composición una agente solidificante. generalmente el color. aire.) (2). Son medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes.características especificas por ejemplo: contener sustancias nutritivas como proteínas.sintéticos: en su composición aparecen sustancias químicas definidas. . y aislar. tales como la sangre de carnero.líquidos: no contiene ningún agente solidificante Según se Composición: . . azucares. estar protegidos de posibles contaminaciones. . Obtención de células de microorganismos patógenos o de sus toxinas para la elaboración de productos biológicos (vacunas. Según se Estado Físico: . Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida (3). Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Preparación del Agar Mueller Hinton 1. (2). Clasificación Cultivo de los Medios de menor que en los medios de cultivo sólidos. presentan una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a estudiar. excrementos. sin exigencias nutritivas especiales (1). de esta forma.semisintéticos: en su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas. El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que esta cultivando y el porque de dicho cultivo. . Conservación durante meses y años de las cepas identificadas.

a 121ºC durante 15 minutos. MATERIALES Y MÉTODOS Para la preparación del medio de cultivo se utilizo el agar Mueller Hinton y se tomaron en cuenta las especificaciones de preparación dadas por la casa comercial. se dosifica en placa de petri a un volumen de 20ml (1).2. 20ml para cajas grandes 15ml para cajas medianas 10ml para cajas pequeñas . se esteriliza en autoclave. a la cual se le realizo limpieza previa con alcohol al 70% y se puso a funcionar el aire estéril de la cámara durante 30 minutos. esto en condiciones estériles en cámara de flujo laminar. Después de realizado el proceso de esterilización en el autoclave se observo en el vaso de precipitado la formación del agar con textura semilíquida y de color amarillo muy claro. Inicialmente se realizo el cálculo de la cantidad de agar necesario para la preparación del medio de cultivo. Después de obtenida la solución de agar. Seguidamente se calentó a 250ºC hasta que iniciara a hervir. el cual se adicionó en una vaso de precipitado que contenía 20ml de agua destilada que se uso como diluyente del agar. como se observa en la figura #1. se realizo proceso de esterilización con autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121ºC. Una vez dispensado el medio de cultivo en las cajas de petri. luego se adiciono en dos cajas de petri pequeñas aproximadamente 10ml de la preparación. Finalizado este proceso se procedió a dispensar el medio. o sea se tomo 1. realizando inicialmente limpieza con alcohol alrededor del vaso de precipitado para evitar contaminación del medio de cultivo. estas se sellaron con cinta de enmascarar y se colocaron a incubar a 37ºC durante 24 horas para verificación de prueba de esterilidad.86gr de agar (incluido el peso del papel: 1. RESULTADOS Cálculos Necesarios para Preparar la Cantidad de Medio de Cultivo Deseado Se deben preparar dos cajas de petri pequeñas con agar Mueller Hinton.1gr). 3.

.. 17g Estando con pH de 7. sin observarse crecimiento sobre la superficie de ninguna población bacteriana. se utilizo agar Mueller Hinton de la casa comercial OXOID. así como la infusión de carne y los ácidos de casamino. indica que Figura #1 agar Mueller Hinton después de proceso de esterilización.5g ... (código CM 337) para la preparación del medio de cultivo.Agar ……………………………. permitieron observar que el medio de cultivo con agar Mueller Hinton continuaba de color amarillo claro.17.. 1. .. indicando ser un medio de cultivo viable para su uso. lo cual se observo durante la preparación del medio de cultivo (2).Almidón……………………..3 y una Tº entre 0.Infusión de carne …………….. La cantidad de agar encontrada en la composición química (17g)...ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Como se menciono anteriormente.. ….5g .Ácidos de casamino……….. Figura #2. una vez sembrada la placa.1 a 25ºC.. Los resultados obtenidos en las cajas de petri luego de la prueba de esterilidad. Dentro de su composición en un litro encontramos: . La técnica de trabajo con este medio consiste en depositar. El agar Mueller Hinton se utiliza en la comprobación de la susceptibilidad de microorganismos a antibióticos.. y constatar así la inhibición de los distintos discos en sus distintas concentraciones de antibiótico (1) El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Figura #2 agar Mueller Hinton después de prueba de esterilidad. transparente y sin materiales termolabiles (1) como se observa en la figura #1... en la superficie. para poder ver el halo que se forma alrededor del disco. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Es un medio simple. discos de papel impregnados de antibiótico a probar.. El almidón contribuye al fomento en el crecimiento.. que sirven de nutrientes al medio (seleccionados estos para dar la mayor transparencia posible al medio).2g .

Madigan. Disponible en INTERNET: <URL:http:agronomia. S. p 67. El vapor a presión (autoclave) es el método más eficaz y practico para esterilizar con calor. Las técnicas de esterilización han de destruir todos los tipos de vida microbiana (4). M. C. p 76. Ingraham. 5. se observa de color amarillo claro. • Se aplico la técnica de esterilización de vapor a presión (autoclave). [En linea]. Figura #2.doc> 3. M. Martinko. • Se conoció el método de prueba de esterilidad para verificar viabilidad de los medios de cultivo. M. J. Prentice Hall Iberia. Bacteriología y Micología Médicas. . La exposición al vapor en un autoclave. para medios de cultivo en agar y caldo nutritivo. el medio se sobrecalentaría y afectaría a las cualidades del medio y su pH (1). Amich. Montealegre. Volumen I. Mc Graw Hill Interamericana. esto se hace normalmente por calor. p 15. Octava edición revisada. Segunda Edición. H. El vapor a presión penetra mucho y es particularmente eficaz ya que se condensa sobre un objeto frió para liberar 596 cal por g (calor de condensación). matara todas las formas de vida. el medio puede presentar problemas de esterilidad. debe ponerse mucha atención en el tiempo de esterilización. 4. Ingraham. p. México. España. A. 87. [citado 2002]. 1999. Manual de laboratorio clínico básico "Microbiología". Parker. Brock Biología de los Microorganismos. W. Polanco.68. Laboratorio #3. Salve. 91. a 15 libras de presión (121ºC) y durante 20 minutos. Interamericana Mc Graw Hill. Russell. Por consiguiente se debe esterilizar el medio de cultivo inmediatamente después de su preparación para eliminar los microorganismos que lo contaminan. S. Preparación de Medios de Cultivo para Hongos y Bacterias. 1991. 2. 85. Universidad de Chile. Prentiss. se dispersan fácilmente por el aire y las superficies. Prieto. Pero es también importante tomar las debidas precauciones durante el manejo posterior de un medio de cultivo estéril para lograr excluir de el todos los microorganismos (5). BIBLIOGRAFÍA 1. 92. y si excediera el tiempo preciso. Quentin.cl/web cursos/microbiologiagral/pagina% 20microbiologia1/Word/guia_lab07 _ (1). J. Los microorganismos se encuentran en todas partes y. Introducción a la Microbiología. Antes de proceder a realizar un cultivo se microorganismos se debe considerar como evitar los contaminantes. 1998. Departamento de Sanidad Vegetal. Referente a la esterilización del medio de cultivo. La condensación permite que mas vapor entre en contacto con los objetos que se están esterilizando (4). CONCLUSIONES • Se aprendió y manejo la técnica empleada para la preparación de medios de cultivo. J. Madrid. 77. Delgado.uchile. y debido a componentes como la infusión de carne y los ácidos de casamino. 2001. Reverte SA. debido a su pequeño tamaño. porque si el proceso no dura el tiempo preciso. 16. España. J. 80. A.corresponde a un medio de cultivo solidó. Chile.

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