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Informe 6(Preparacion y Esterilizacion de Medios de Cultivo)

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Preparación, Esterilización y Prueba de Esterilidad para Agar Mueller Hinton Méndez, Helena – Palacios, Hasleidy Universidad de Boyacá – Facultad

Ciencias de la Salud – Bacteriología y Laboratorio Clínico RESUMEN En condiciones de laboratorio se realizó la preparación de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparación dadas por la casa comercial. Basados en esta información se realizaron los cálculos adecuados para la preparación de 20ml de Agar Mueller Hinton, que serian distribuidos en dos cajas de petri pequeñas. Inicialmente se pesaron 1.86 gr. del agar (en polvo) incluido el peso del papel, necesarios para la preparación del medio de cultivo. Seguidamente se diluyo la cantidad del medio de cultivo en un vaso de precipitado que contenía 20 ml de agua destilada, y se calentó a 250ºC hasta que hirviera; una vez obtenida la preparación, se llevo a esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Luego se procedió a distribuir en las dos cajas de petri el medio de cultivo (aproximadamente 10 ml en cada una) utilizando la cámara de flujo laminar, para evitar la contaminación de este. Finalmente se realizo la prueba de esterilidad, incubando los medios de cultivos preparados durante 24 horas con una temperatura de 37ºC. Las observaciones posteriores al periodo de tiempo requerido para la incubación del medio de cultivo, arrojaron resultados negativos para el crecimiento de colonias, indicando que el método de esterilización empleado es efectivo, y que el medio de cultivo puede ser utilizado para el aislamiento de diferentes microorganismos. PALABRAS CLAVE: Agar Mueller Hinton, esterilización, medios de cultivo, prueba de esterilidad. INTRODUCCIÓN Fue en 1876 cuando Koch fue capaz de propagar una bacteria patógena (Bacillus anthracis) en cultivo puro, fuera del cuerpo que la portaba; en 1881, utilizando un medio liquido, lo solidifico con gelatina y desarrollo los métodos de rayado y siembra en placa para aislamiento de bacterias. El siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, al utilizar como agente solidificante un producto denominado agar, extraído de las algas rojas. El agar era muy superior a la gelatina, ya que era resistente a la digestión microbiana y a la licuefacción. Se enriqueció la composición de los cultivos solidificados utilizando extractos de carne e infusiones, a fin de equipararlos con el tejido infectado portador (1). Para el aislamiento, estudio y clasificación de los microorganismos, es necesario utilizar un medio de cultivo en el que se dispongan de las sustancias orgánicas e inorgánicas necesarias e indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los microorganismos además de poder multiplicarse, pueden manifestar características de crecimiento y propiedades bioquímicas, aspectos de gran importancia para su clasificación. (2). Estos preparado, poseen

Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales.semisólidos: presentan agar en su composición pero en una proporción . .Medios diferenciales: contienen colorantes. Son medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes. Obtención de células de microorganismos patógenos o de sus toxinas para la elaboración de productos biológicos (vacunas. el microorganismo que se busca. tales como la sangre de carnero. Clasificación Cultivo de los Medios de menor que en los medios de cultivo sólidos. Conservación durante meses y años de las cepas identificadas. El matraz se cierra con doble capa de papel aluminio. tener un pH adecuado.líquidos: no contiene ningún agente solidificante Según se Composición: . estar protegidos de posibles contaminaciones. (2). propiedades tintoriales y reacciones bioquímicas. . . pus.características especificas por ejemplo: contener sustancias nutritivas como proteínas.). de esta forma. hasta su completa disolución. excrementos. El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que esta cultivando y el porque de dicho cultivo. . según las características de crecimiento. aire. sin exigencias nutritivas especiales (1). y estar esterilizados. etc. morfología celular. Según se Estado Físico: . .semisintéticos: en su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas. Ventajas al Utilizar los Medios de Cultivo.empíricos: en su composición aparecen sustancias orgánicas. permite el aislamiento de un microorganismo a partir de un sustrato natural (suelo. . antitoxinas. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida (3). agua. Según el uso a que se destinen: . plantas. el agar. minerales y vitaminas.Medios de uso general: son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos. generalmente el color. se disuelven 38g en un litro de agua destilada. etc.medios enriquecidos: suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores. concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida. presentan una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a estudiar. Preparación del Agar Mueller Hinton 1.sintéticos: en su composición aparecen sustancias químicas definidas. . en una proporción de 12 a 15 gramos por litro. y aislar.Sólidos: presentan en su composición una agente solidificante. calentándolo y agitándolo al mismo tiempo. azucares. azucares e indicadores.Medios selectivos: además de contar en su composición con los mismos productos que los medios diferenciales.) (2). permite la identificación del microorganismo.

RESULTADOS Cálculos Necesarios para Preparar la Cantidad de Medio de Cultivo Deseado Se deben preparar dos cajas de petri pequeñas con agar Mueller Hinton. Después de realizado el proceso de esterilización en el autoclave se observo en el vaso de precipitado la formación del agar con textura semilíquida y de color amarillo muy claro. se esteriliza en autoclave.2. 20ml para cajas grandes 15ml para cajas medianas 10ml para cajas pequeñas . o sea se tomo 1. a 121ºC durante 15 minutos. Una vez dispensado el medio de cultivo en las cajas de petri. Después de obtenida la solución de agar. Inicialmente se realizo el cálculo de la cantidad de agar necesario para la preparación del medio de cultivo. como se observa en la figura #1. Finalizado este proceso se procedió a dispensar el medio.86gr de agar (incluido el peso del papel: 1. Seguidamente se calentó a 250ºC hasta que iniciara a hervir. 3. se dosifica en placa de petri a un volumen de 20ml (1). realizando inicialmente limpieza con alcohol alrededor del vaso de precipitado para evitar contaminación del medio de cultivo. el cual se adicionó en una vaso de precipitado que contenía 20ml de agua destilada que se uso como diluyente del agar.1gr). a la cual se le realizo limpieza previa con alcohol al 70% y se puso a funcionar el aire estéril de la cámara durante 30 minutos. esto en condiciones estériles en cámara de flujo laminar. se realizo proceso de esterilización con autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121ºC. luego se adiciono en dos cajas de petri pequeñas aproximadamente 10ml de la preparación. MATERIALES Y MÉTODOS Para la preparación del medio de cultivo se utilizo el agar Mueller Hinton y se tomaron en cuenta las especificaciones de preparación dadas por la casa comercial. estas se sellaron con cinta de enmascarar y se colocaron a incubar a 37ºC durante 24 horas para verificación de prueba de esterilidad.

. Figura #2. transparente y sin materiales termolabiles (1) como se observa en la figura #1. sin observarse crecimiento sobre la superficie de ninguna población bacteriana.. Dentro de su composición en un litro encontramos: . indica que Figura #1 agar Mueller Hinton después de proceso de esterilización.5g . discos de papel impregnados de antibiótico a probar.Ácidos de casamino………..ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Como se menciono anteriormente.2g . ..1 a 25ºC.Almidón……………………. El agar Mueller Hinton se utiliza en la comprobación de la susceptibilidad de microorganismos a antibióticos. (código CM 337) para la preparación del medio de cultivo... Los resultados obtenidos en las cajas de petri luego de la prueba de esterilidad. se utilizo agar Mueller Hinton de la casa comercial OXOID. lo cual se observo durante la preparación del medio de cultivo (2).. y constatar así la inhibición de los distintos discos en sus distintas concentraciones de antibiótico (1) El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo.. permitieron observar que el medio de cultivo con agar Mueller Hinton continuaba de color amarillo claro. El almidón contribuye al fomento en el crecimiento. Figura #2 agar Mueller Hinton después de prueba de esterilidad. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados...5g .. La técnica de trabajo con este medio consiste en depositar. …. 17g Estando con pH de 7... que sirven de nutrientes al medio (seleccionados estos para dar la mayor transparencia posible al medio). Es un medio simple. así como la infusión de carne y los ácidos de casamino..3 y una Tº entre 0... para poder ver el halo que se forma alrededor del disco.Agar ……………………………. en la superficie. una vez sembrada la placa.Infusión de carne …………….. 1. indicando ser un medio de cultivo viable para su uso.. La cantidad de agar encontrada en la composición química (17g).17.

Pero es también importante tomar las debidas precauciones durante el manejo posterior de un medio de cultivo estéril para lograr excluir de el todos los microorganismos (5). 1998. Bacteriología y Micología Médicas. J. • Se aplico la técnica de esterilización de vapor a presión (autoclave). S. 85. 1999. Las técnicas de esterilización han de destruir todos los tipos de vida microbiana (4). Russell. debe ponerse mucha atención en el tiempo de esterilización. México. 91. Ingraham. se observa de color amarillo claro. El vapor a presión (autoclave) es el método más eficaz y practico para esterilizar con calor. Montealegre. Reverte SA. Prentiss. BIBLIOGRAFÍA 1. se dispersan fácilmente por el aire y las superficies. 80. J. 87. 1991. p 67. El vapor a presión penetra mucho y es particularmente eficaz ya que se condensa sobre un objeto frió para liberar 596 cal por g (calor de condensación). Madigan. Manual de laboratorio clínico básico "Microbiología".corresponde a un medio de cultivo solidó. A. Brock Biología de los Microorganismos. para medios de cultivo en agar y caldo nutritivo. M. p 15. 5. Universidad de Chile. 2. Madrid. Quentin. Antes de proceder a realizar un cultivo se microorganismos se debe considerar como evitar los contaminantes. esto se hace normalmente por calor. Polanco. Interamericana Mc Graw Hill. porque si el proceso no dura el tiempo preciso. Martinko. p. [En linea]. Amich. Chile. 92. Prieto. a 15 libras de presión (121ºC) y durante 20 minutos. M. Departamento de Sanidad Vegetal. H. Prentice Hall Iberia. Volumen I. Salve. Los microorganismos se encuentran en todas partes y. Disponible en INTERNET: <URL:http:agronomia. C. Parker. Octava edición revisada. el medio puede presentar problemas de esterilidad. CONCLUSIONES • Se aprendió y manejo la técnica empleada para la preparación de medios de cultivo. A. matara todas las formas de vida. Mc Graw Hill Interamericana. 16. Introducción a la Microbiología.uchile. España. Ingraham. J. p 76. 2001. Por consiguiente se debe esterilizar el medio de cultivo inmediatamente después de su preparación para eliminar los microorganismos que lo contaminan. 4. • Se conoció el método de prueba de esterilidad para verificar viabilidad de los medios de cultivo.doc> 3. La condensación permite que mas vapor entre en contacto con los objetos que se están esterilizando (4). y si excediera el tiempo preciso.cl/web cursos/microbiologiagral/pagina% 20microbiologia1/Word/guia_lab07 _ (1). debido a su pequeño tamaño. S. Laboratorio #3. J. el medio se sobrecalentaría y afectaría a las cualidades del medio y su pH (1). W. Delgado. Segunda Edición. 77. . Referente a la esterilización del medio de cultivo. España.68. Figura #2. La exposición al vapor en un autoclave. Preparación de Medios de Cultivo para Hongos y Bacterias. M. [citado 2002]. y debido a componentes como la infusión de carne y los ácidos de casamino.

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