Preparación, Esterilización y Prueba de Esterilidad para Agar Mueller Hinton Méndez, Helena – Palacios, Hasleidy Universidad de Boyacá – Facultad

Ciencias de la Salud – Bacteriología y Laboratorio Clínico RESUMEN En condiciones de laboratorio se realizó la preparación de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparación dadas por la casa comercial. Basados en esta información se realizaron los cálculos adecuados para la preparación de 20ml de Agar Mueller Hinton, que serian distribuidos en dos cajas de petri pequeñas. Inicialmente se pesaron 1.86 gr. del agar (en polvo) incluido el peso del papel, necesarios para la preparación del medio de cultivo. Seguidamente se diluyo la cantidad del medio de cultivo en un vaso de precipitado que contenía 20 ml de agua destilada, y se calentó a 250ºC hasta que hirviera; una vez obtenida la preparación, se llevo a esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Luego se procedió a distribuir en las dos cajas de petri el medio de cultivo (aproximadamente 10 ml en cada una) utilizando la cámara de flujo laminar, para evitar la contaminación de este. Finalmente se realizo la prueba de esterilidad, incubando los medios de cultivos preparados durante 24 horas con una temperatura de 37ºC. Las observaciones posteriores al periodo de tiempo requerido para la incubación del medio de cultivo, arrojaron resultados negativos para el crecimiento de colonias, indicando que el método de esterilización empleado es efectivo, y que el medio de cultivo puede ser utilizado para el aislamiento de diferentes microorganismos. PALABRAS CLAVE: Agar Mueller Hinton, esterilización, medios de cultivo, prueba de esterilidad. INTRODUCCIÓN Fue en 1876 cuando Koch fue capaz de propagar una bacteria patógena (Bacillus anthracis) en cultivo puro, fuera del cuerpo que la portaba; en 1881, utilizando un medio liquido, lo solidifico con gelatina y desarrollo los métodos de rayado y siembra en placa para aislamiento de bacterias. El siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, al utilizar como agente solidificante un producto denominado agar, extraído de las algas rojas. El agar era muy superior a la gelatina, ya que era resistente a la digestión microbiana y a la licuefacción. Se enriqueció la composición de los cultivos solidificados utilizando extractos de carne e infusiones, a fin de equipararlos con el tejido infectado portador (1). Para el aislamiento, estudio y clasificación de los microorganismos, es necesario utilizar un medio de cultivo en el que se dispongan de las sustancias orgánicas e inorgánicas necesarias e indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los microorganismos además de poder multiplicarse, pueden manifestar características de crecimiento y propiedades bioquímicas, aspectos de gran importancia para su clasificación. (2). Estos preparado, poseen

. generalmente el color.semisintéticos: en su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. el agar. El matraz se cierra con doble capa de papel aluminio. . aire. Ventajas al Utilizar los Medios de Cultivo. minerales y vitaminas. y aislar. morfología celular. en una proporción de 12 a 15 gramos por litro.características especificas por ejemplo: contener sustancias nutritivas como proteínas. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida (3). hasta su completa disolución. Preparación del Agar Mueller Hinton 1. .líquidos: no contiene ningún agente solidificante Según se Composición: . tener un pH adecuado. etc. . permite el aislamiento de un microorganismo a partir de un sustrato natural (suelo.empíricos: en su composición aparecen sustancias orgánicas.). y estar esterilizados. . . el microorganismo que se busca.sintéticos: en su composición aparecen sustancias químicas definidas.) (2).medios enriquecidos: suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores. agua.Medios diferenciales: contienen colorantes. tales como la sangre de carnero. concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida. Según se Estado Físico: . Según el uso a que se destinen: .semisólidos: presentan agar en su composición pero en una proporción . Obtención de células de microorganismos patógenos o de sus toxinas para la elaboración de productos biológicos (vacunas. presentan una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a estudiar.Sólidos: presentan en su composición una agente solidificante. calentándolo y agitándolo al mismo tiempo. estar protegidos de posibles contaminaciones. pus. propiedades tintoriales y reacciones bioquímicas. etc. según las características de crecimiento. permite la identificación del microorganismo. azucares e indicadores.Medios selectivos: además de contar en su composición con los mismos productos que los medios diferenciales. de esta forma. . sin exigencias nutritivas especiales (1). se disuelven 38g en un litro de agua destilada. plantas. Son medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes. (2). Conservación durante meses y años de las cepas identificadas. excrementos. antitoxinas. azucares. El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que esta cultivando y el porque de dicho cultivo.Medios de uso general: son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos. Clasificación Cultivo de los Medios de menor que en los medios de cultivo sólidos.

Finalizado este proceso se procedió a dispensar el medio. a la cual se le realizo limpieza previa con alcohol al 70% y se puso a funcionar el aire estéril de la cámara durante 30 minutos. o sea se tomo 1. a 121ºC durante 15 minutos.86gr de agar (incluido el peso del papel: 1. RESULTADOS Cálculos Necesarios para Preparar la Cantidad de Medio de Cultivo Deseado Se deben preparar dos cajas de petri pequeñas con agar Mueller Hinton. como se observa en la figura #1. se dosifica en placa de petri a un volumen de 20ml (1).2. luego se adiciono en dos cajas de petri pequeñas aproximadamente 10ml de la preparación. se esteriliza en autoclave. Una vez dispensado el medio de cultivo en las cajas de petri. estas se sellaron con cinta de enmascarar y se colocaron a incubar a 37ºC durante 24 horas para verificación de prueba de esterilidad. Seguidamente se calentó a 250ºC hasta que iniciara a hervir. esto en condiciones estériles en cámara de flujo laminar. MATERIALES Y MÉTODOS Para la preparación del medio de cultivo se utilizo el agar Mueller Hinton y se tomaron en cuenta las especificaciones de preparación dadas por la casa comercial. 20ml para cajas grandes 15ml para cajas medianas 10ml para cajas pequeñas . 3. realizando inicialmente limpieza con alcohol alrededor del vaso de precipitado para evitar contaminación del medio de cultivo. se realizo proceso de esterilización con autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121ºC. Después de realizado el proceso de esterilización en el autoclave se observo en el vaso de precipitado la formación del agar con textura semilíquida y de color amarillo muy claro. Inicialmente se realizo el cálculo de la cantidad de agar necesario para la preparación del medio de cultivo. el cual se adicionó en una vaso de precipitado que contenía 20ml de agua destilada que se uso como diluyente del agar.1gr). Después de obtenida la solución de agar.

. indica que Figura #1 agar Mueller Hinton después de proceso de esterilización. El almidón contribuye al fomento en el crecimiento.. en la superficie. .17. lo cual se observo durante la preparación del medio de cultivo (2).ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Como se menciono anteriormente... Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. permitieron observar que el medio de cultivo con agar Mueller Hinton continuaba de color amarillo claro...1 a 25ºC.5g . Figura #2 agar Mueller Hinton después de prueba de esterilidad....5g . para poder ver el halo que se forma alrededor del disco. Dentro de su composición en un litro encontramos: . 17g Estando con pH de 7.Ácidos de casamino………. Los resultados obtenidos en las cajas de petri luego de la prueba de esterilidad. transparente y sin materiales termolabiles (1) como se observa en la figura #1. La cantidad de agar encontrada en la composición química (17g). Es un medio simple. El agar Mueller Hinton se utiliza en la comprobación de la susceptibilidad de microorganismos a antibióticos. discos de papel impregnados de antibiótico a probar. (código CM 337) para la preparación del medio de cultivo.2g . La técnica de trabajo con este medio consiste en depositar.... así como la infusión de carne y los ácidos de casamino. que sirven de nutrientes al medio (seleccionados estos para dar la mayor transparencia posible al medio). y constatar así la inhibición de los distintos discos en sus distintas concentraciones de antibiótico (1) El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. se utilizo agar Mueller Hinton de la casa comercial OXOID. …. sin observarse crecimiento sobre la superficie de ninguna población bacteriana.Agar ……………………………. indicando ser un medio de cultivo viable para su uso. una vez sembrada la placa.Almidón…………………….. 1...Infusión de carne …………….. Figura #2.3 y una Tº entre 0...

esto se hace normalmente por calor. H.cl/web cursos/microbiologiagral/pagina% 20microbiologia1/Word/guia_lab07 _ (1). Octava edición revisada. Disponible en INTERNET: <URL:http:agronomia. La condensación permite que mas vapor entre en contacto con los objetos que se están esterilizando (4). . [citado 2002]. el medio puede presentar problemas de esterilidad. 1991. Laboratorio #3. J. y debido a componentes como la infusión de carne y los ácidos de casamino. [En linea]. 85. Referente a la esterilización del medio de cultivo. • Se aplico la técnica de esterilización de vapor a presión (autoclave). BIBLIOGRAFÍA 1. Prentice Hall Iberia. Reverte SA. 4. C. 80.uchile. J. Figura #2. p 67. 92. A. debe ponerse mucha atención en el tiempo de esterilización. CONCLUSIONES • Se aprendió y manejo la técnica empleada para la preparación de medios de cultivo. Universidad de Chile. p. Prieto. S. 87. M. J. • Se conoció el método de prueba de esterilidad para verificar viabilidad de los medios de cultivo. Interamericana Mc Graw Hill. y si excediera el tiempo preciso. A. 2001. Brock Biología de los Microorganismos. Amich. 1999. Manual de laboratorio clínico básico "Microbiología". Antes de proceder a realizar un cultivo se microorganismos se debe considerar como evitar los contaminantes. J.68. Quentin. se dispersan fácilmente por el aire y las superficies. p 15. Volumen I. El vapor a presión (autoclave) es el método más eficaz y practico para esterilizar con calor. España. Por consiguiente se debe esterilizar el medio de cultivo inmediatamente después de su preparación para eliminar los microorganismos que lo contaminan. se observa de color amarillo claro. Salve. porque si el proceso no dura el tiempo preciso. Delgado. Russell. 77. Montealegre. Chile. M. el medio se sobrecalentaría y afectaría a las cualidades del medio y su pH (1). Departamento de Sanidad Vegetal. 16. Prentiss. matara todas las formas de vida. Martinko. p 76. Bacteriología y Micología Médicas.corresponde a un medio de cultivo solidó. Mc Graw Hill Interamericana. España. Preparación de Medios de Cultivo para Hongos y Bacterias. para medios de cultivo en agar y caldo nutritivo. Segunda Edición. El vapor a presión penetra mucho y es particularmente eficaz ya que se condensa sobre un objeto frió para liberar 596 cal por g (calor de condensación). Parker. La exposición al vapor en un autoclave. 5. M. 1998. debido a su pequeño tamaño. W. 2. Ingraham. 91. Los microorganismos se encuentran en todas partes y. Madrid. Pero es también importante tomar las debidas precauciones durante el manejo posterior de un medio de cultivo estéril para lograr excluir de el todos los microorganismos (5). Introducción a la Microbiología. Ingraham. S.doc> 3. Polanco. Las técnicas de esterilización han de destruir todos los tipos de vida microbiana (4). a 15 libras de presión (121ºC) y durante 20 minutos. Madigan. México.

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