Preparación, Esterilización y Prueba de Esterilidad para Agar Mueller Hinton Méndez, Helena – Palacios, Hasleidy Universidad de Boyacá – Facultad

Ciencias de la Salud – Bacteriología y Laboratorio Clínico RESUMEN En condiciones de laboratorio se realizó la preparación de Agar Mueller Hinton como medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparación dadas por la casa comercial. Basados en esta información se realizaron los cálculos adecuados para la preparación de 20ml de Agar Mueller Hinton, que serian distribuidos en dos cajas de petri pequeñas. Inicialmente se pesaron 1.86 gr. del agar (en polvo) incluido el peso del papel, necesarios para la preparación del medio de cultivo. Seguidamente se diluyo la cantidad del medio de cultivo en un vaso de precipitado que contenía 20 ml de agua destilada, y se calentó a 250ºC hasta que hirviera; una vez obtenida la preparación, se llevo a esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121ºC. Luego se procedió a distribuir en las dos cajas de petri el medio de cultivo (aproximadamente 10 ml en cada una) utilizando la cámara de flujo laminar, para evitar la contaminación de este. Finalmente se realizo la prueba de esterilidad, incubando los medios de cultivos preparados durante 24 horas con una temperatura de 37ºC. Las observaciones posteriores al periodo de tiempo requerido para la incubación del medio de cultivo, arrojaron resultados negativos para el crecimiento de colonias, indicando que el método de esterilización empleado es efectivo, y que el medio de cultivo puede ser utilizado para el aislamiento de diferentes microorganismos. PALABRAS CLAVE: Agar Mueller Hinton, esterilización, medios de cultivo, prueba de esterilidad. INTRODUCCIÓN Fue en 1876 cuando Koch fue capaz de propagar una bacteria patógena (Bacillus anthracis) en cultivo puro, fuera del cuerpo que la portaba; en 1881, utilizando un medio liquido, lo solidifico con gelatina y desarrollo los métodos de rayado y siembra en placa para aislamiento de bacterias. El siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, al utilizar como agente solidificante un producto denominado agar, extraído de las algas rojas. El agar era muy superior a la gelatina, ya que era resistente a la digestión microbiana y a la licuefacción. Se enriqueció la composición de los cultivos solidificados utilizando extractos de carne e infusiones, a fin de equipararlos con el tejido infectado portador (1). Para el aislamiento, estudio y clasificación de los microorganismos, es necesario utilizar un medio de cultivo en el que se dispongan de las sustancias orgánicas e inorgánicas necesarias e indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los microorganismos además de poder multiplicarse, pueden manifestar características de crecimiento y propiedades bioquímicas, aspectos de gran importancia para su clasificación. (2). Estos preparado, poseen

azucares e indicadores. aire. . Obtención de células de microorganismos patógenos o de sus toxinas para la elaboración de productos biológicos (vacunas. generalmente el color. pus.Medios de uso general: son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos. Preparación del Agar Mueller Hinton 1. tales como la sangre de carnero. y aislar. etc.empíricos: en su composición aparecen sustancias orgánicas.Medios selectivos: además de contar en su composición con los mismos productos que los medios diferenciales. según las características de crecimiento. etc. Son medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes. Conservación durante meses y años de las cepas identificadas.medios enriquecidos: suelen ser medios con un nutriente simple que presentan enriquecedores. se disuelven 38g en un litro de agua destilada. tener un pH adecuado. sin exigencias nutritivas especiales (1). Según se Estado Físico: . . permite la identificación del microorganismo. el agar. morfología celular. presentan una serie de agentes que sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a estudiar. azucares. concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida. (2). excrementos. .Sólidos: presentan en su composición una agente solidificante. Ventajas al Utilizar los Medios de Cultivo. estar protegidos de posibles contaminaciones. . Según el uso a que se destinen: . y estar esterilizados. El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que esta cultivando y el porque de dicho cultivo.) (2).características especificas por ejemplo: contener sustancias nutritivas como proteínas. .sintéticos: en su composición aparecen sustancias químicas definidas. calentándolo y agitándolo al mismo tiempo. minerales y vitaminas. de esta forma. El matraz se cierra con doble capa de papel aluminio. Clasificación Cultivo de los Medios de menor que en los medios de cultivo sólidos. plantas. .). propiedades tintoriales y reacciones bioquímicas. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. permite el aislamiento de un microorganismo a partir de un sustrato natural (suelo. en una proporción de 12 a 15 gramos por litro. agua.Medios diferenciales: contienen colorantes. el microorganismo que se busca. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida (3). antitoxinas.semisólidos: presentan agar en su composición pero en una proporción . .semisintéticos: en su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas. hasta su completa disolución.líquidos: no contiene ningún agente solidificante Según se Composición: .

1gr). luego se adiciono en dos cajas de petri pequeñas aproximadamente 10ml de la preparación. 20ml para cajas grandes 15ml para cajas medianas 10ml para cajas pequeñas . esto en condiciones estériles en cámara de flujo laminar. Después de obtenida la solución de agar. a la cual se le realizo limpieza previa con alcohol al 70% y se puso a funcionar el aire estéril de la cámara durante 30 minutos.2. RESULTADOS Cálculos Necesarios para Preparar la Cantidad de Medio de Cultivo Deseado Se deben preparar dos cajas de petri pequeñas con agar Mueller Hinton. realizando inicialmente limpieza con alcohol alrededor del vaso de precipitado para evitar contaminación del medio de cultivo. se esteriliza en autoclave. MATERIALES Y MÉTODOS Para la preparación del medio de cultivo se utilizo el agar Mueller Hinton y se tomaron en cuenta las especificaciones de preparación dadas por la casa comercial. se dosifica en placa de petri a un volumen de 20ml (1). Finalizado este proceso se procedió a dispensar el medio. el cual se adicionó en una vaso de precipitado que contenía 20ml de agua destilada que se uso como diluyente del agar. Inicialmente se realizo el cálculo de la cantidad de agar necesario para la preparación del medio de cultivo. a 121ºC durante 15 minutos. 3. como se observa en la figura #1. estas se sellaron con cinta de enmascarar y se colocaron a incubar a 37ºC durante 24 horas para verificación de prueba de esterilidad. Seguidamente se calentó a 250ºC hasta que iniciara a hervir. Después de realizado el proceso de esterilización en el autoclave se observo en el vaso de precipitado la formación del agar con textura semilíquida y de color amarillo muy claro. se realizo proceso de esterilización con autoclave durante 15 minutos a una temperatura de 121ºC.86gr de agar (incluido el peso del papel: 1. o sea se tomo 1. Una vez dispensado el medio de cultivo en las cajas de petri.

para poder ver el halo que se forma alrededor del disco. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados.. Dentro de su composición en un litro encontramos: .17. que sirven de nutrientes al medio (seleccionados estos para dar la mayor transparencia posible al medio). indica que Figura #1 agar Mueller Hinton después de proceso de esterilización. así como la infusión de carne y los ácidos de casamino.. La técnica de trabajo con este medio consiste en depositar.. 1. La cantidad de agar encontrada en la composición química (17g). lo cual se observo durante la preparación del medio de cultivo (2). (código CM 337) para la preparación del medio de cultivo.Ácidos de casamino………. en la superficie.. El almidón contribuye al fomento en el crecimiento.. Los resultados obtenidos en las cajas de petri luego de la prueba de esterilidad. …. El agar Mueller Hinton se utiliza en la comprobación de la susceptibilidad de microorganismos a antibióticos..Almidón…………………….Infusión de carne …………….. Figura #2 agar Mueller Hinton después de prueba de esterilidad.5g . indicando ser un medio de cultivo viable para su uso.2g .... 17g Estando con pH de 7. ... discos de papel impregnados de antibiótico a probar.. se utilizo agar Mueller Hinton de la casa comercial OXOID. y constatar así la inhibición de los distintos discos en sus distintas concentraciones de antibiótico (1) El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo.3 y una Tº entre 0. sin observarse crecimiento sobre la superficie de ninguna población bacteriana.5g .. Figura #2.. transparente y sin materiales termolabiles (1) como se observa en la figura #1.. Es un medio simple.ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Como se menciono anteriormente..Agar …………………………….. una vez sembrada la placa. permitieron observar que el medio de cultivo con agar Mueller Hinton continuaba de color amarillo claro.1 a 25ºC.

2001. Segunda Edición. 16.cl/web cursos/microbiologiagral/pagina% 20microbiologia1/Word/guia_lab07 _ (1). se observa de color amarillo claro. Referente a la esterilización del medio de cultivo.68. Parker. México. W. y si excediera el tiempo preciso. J. Universidad de Chile. El vapor a presión penetra mucho y es particularmente eficaz ya que se condensa sobre un objeto frió para liberar 596 cal por g (calor de condensación). se dispersan fácilmente por el aire y las superficies. H. para medios de cultivo en agar y caldo nutritivo. p 67. Polanco. Interamericana Mc Graw Hill. Introducción a la Microbiología. Mc Graw Hill Interamericana. a 15 libras de presión (121ºC) y durante 20 minutos. Ingraham. Bacteriología y Micología Médicas. Las técnicas de esterilización han de destruir todos los tipos de vida microbiana (4). el medio se sobrecalentaría y afectaría a las cualidades del medio y su pH (1). Departamento de Sanidad Vegetal. Montealegre. Russell. 1998. CONCLUSIONES • Se aprendió y manejo la técnica empleada para la preparación de medios de cultivo. p. España. M. Preparación de Medios de Cultivo para Hongos y Bacterias. El vapor a presión (autoclave) es el método más eficaz y practico para esterilizar con calor. La condensación permite que mas vapor entre en contacto con los objetos que se están esterilizando (4). y debido a componentes como la infusión de carne y los ácidos de casamino. 87. Prentiss. • Se aplico la técnica de esterilización de vapor a presión (autoclave). Chile.uchile. Quentin. Antes de proceder a realizar un cultivo se microorganismos se debe considerar como evitar los contaminantes. 80.doc> 3. • Se conoció el método de prueba de esterilidad para verificar viabilidad de los medios de cultivo. Volumen I. esto se hace normalmente por calor. 1991. porque si el proceso no dura el tiempo preciso. Manual de laboratorio clínico básico "Microbiología". Salve. p 76. debido a su pequeño tamaño. p 15. España. Disponible en INTERNET: <URL:http:agronomia. A. J. 77. Prieto. Brock Biología de los Microorganismos. C. Los microorganismos se encuentran en todas partes y. matara todas las formas de vida. M. Madrid. 1999. J. Martinko. 92. Delgado. Octava edición revisada. Ingraham. BIBLIOGRAFÍA 1. 91. La exposición al vapor en un autoclave. . S. Figura #2. 4. A. el medio puede presentar problemas de esterilidad. Por consiguiente se debe esterilizar el medio de cultivo inmediatamente después de su preparación para eliminar los microorganismos que lo contaminan. [En linea]. 5.corresponde a un medio de cultivo solidó. [citado 2002]. Amich. J. Prentice Hall Iberia. Laboratorio #3. Madigan. Reverte SA. Pero es también importante tomar las debidas precauciones durante el manejo posterior de un medio de cultivo estéril para lograr excluir de el todos los microorganismos (5). 85. debe ponerse mucha atención en el tiempo de esterilización. 2. S. M.