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MEDIOS DE CULTIVO: CLASIFICACIN Y

PREPARACIN
MICROBIOLOGA PESQUERA

2016 - II
INTRODUCCIN

El miclogo Julius Brefeld fue el primero en utilizar medios de cultivo, pues consigui
aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos, los cuales fueron realizados
a base de gelatina, sin embargo, este mtodo no fue til para el cultivo de bacterias
ya que estas eran de menor tamao. Y no fue hasta 1878 que Joseph Lister empleo
un mtodo basado en diluciones seriada en un medio lquido.
Robert Koch realizo sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas
de papa como soporte nutritivo olido, pero no tardo en recurrir al caldo de carne
lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio
solido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las
colonias microbianas.
En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en
relacin con los medios de cultivo, pues el mdico alemn Walter Hesse introdujo
el agar-agar, polisacrido que se extrae de las algas rojas, como solidificante.
El 1887 un ayudante de Koch llamado Julius Richard Petri, fabrica unas placas de
cristal planas, las cuales, posteriormente sern llamadas placas Petri, para sustituir
a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta
entonces.
La importancia de preparar un medio de cultivo microbiolgico es poder generar un
ambiente con los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos
investigados y agentes que permiten la seleccin y diferenciacin de ciertos
microorganismos.
El medio que se utiliza en los anlisis microbiolgicos debe estar estril para
asegurar una correcta interpretacin de los resultados. La esterilizacin en
autoclave y ocasionalmente mediante micro-filtracin son los mtodos que se
utilizan para lograr la esterilidad. Se debe tener mucho cuidado en la manipulacin
de los medios estriles para evitar su contaminacin. Con ello, se asegura que los
microorganismos de inters, tanto si proceden del alimento o estn en cultivo puro,
son los nicos que se introducen (inoculan) en el medio. (Yousef et al., 2003)

OBJETIVOS
Conocer las caractersticas de un medio de cultivo y como se clasifican.
Aprender el procedimiento de la preparacin de un medio de cultivo.
REVISION BIBLIOGRFICA
Clasificacin de los medios de cultivo
Segn su consistencia
Medios lquidos: Son los denominados caldos de cultivo, el medio lquido
ms utilizado es el caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de
carne, peptona y agua.
Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles
un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina:
Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de
que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su punto de fusin es
bajo por lo que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera
ptima de crecimiento. Agar-agar: Es un polmero de azcares obtenido de
algas marinas. Se trata de una molcula insoluble en agua pero soluble en
agua caliente; una solucin al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y
no se funde por debajo de 85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido
alrededor de los 45C. El agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en
1937, los dividi en dos grupos: agarosa, con poco sulfato y libre de cido
pirvico, y en agar o pectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas.
Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos,
agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para
preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad
de las bacterias.
Segn su uso
Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para
que pueda producirse el crecimiento de bacterias. El medio ms conocido de
este grupo es el agar nutritivo o agar comn.
Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias
nutritivas normales, estn enriquecidos por la adicin productos biolgicos
como la sangre, el suero, la leche, el huevo, la bilis, etc. En ocasiones es
posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un
enriquecimiento del mismo como por ejemplo Polivitex, Isovitalex, etc.
Medios selectivos: El fundamento de estos medios consiste en facilitar
nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica.
Medios inhibidores: Cuando algn o algunos de los componentes aadidos
a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin
microbiana, se denomina inhibidor.
Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas
bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies.
Medios de identificacin: Identifican alguna cualidad especfica que puede
servirnos para reconocer un microorganismo. Estos medios han de poseer
los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los
microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el
indicador que nos muestre el resultado.
Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas
a partir de un microorganismo ya aislado.
Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa. En el
laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:
haciendo pases peridicos de placa a placa.
mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana.
congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.
Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que
no pueden sembrarse inmediatamente.
Segn su composicin
Medios complejos: Se preparan a partir de tejidos animales, y raramente de
vegetales. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones
experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la
prctica estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados.
Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin
exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada
en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin
perfectamente definida.
Medios semi-sintticos: En este caso se aportan los factores de
crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo como extracto de
levadura, extracto de tejidos, etc. Ciertos grmenes no crecen en ningn
medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en
clulas vivas con unas caractersticas determinadas.
Segn su origen
Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen
animal o vegetal.
Sintticos: son los medios que contienen una composicin qumica definida
y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
Semi-sintticos: Son los sintticos a los que se les aaden factores de
crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo.
MATERIALES
Para 200 ml de Plate Count Agar
1 g de Triptona
0.2 g de Glucosa
0.5 g de Extracto de levadura
3 g de Agar
200 ml de Agua destilada
Equipos
Balanza analtica
Balanza electrnica
Bao Mara
Autoclave
Otros
Matraz Erlenmeyer
Probeta
Esptula
Papel aluminio
Algodn
Anillos estabilizadores para el matraz
MTODOS
Tener todos los utensilios
limpios

Utilizar la balanza analtica o


Pesado de todos los electrnica, la esptula y
ingredientes pedazos de papel aluminio.

Agregar la mitad del


agua al matraz
Medir el volumen del agua en
una probeta.

Adicionar los
ingredientes secos

Adicionar el resto del


agua destilada Hacer que el agua limpie las
paredes del matraz y no
quede restos de ingredientes
secos.
Agitar y cubrir con un
trozo de algodn

Colocar anillos
Bao Mara de 15 a 20 estabilizadores al matraz para
min que no se voltee en el bao
Mara.

Esterilizar en autoclave
CONCLUSIONES
En conclusin los medios de cultivo se clasifican segn su consistencia, su
uso, su composicin y su origen.
Los medios de cultivo proporcionan un ambiente nutritivo para el desarrollo
de los microorganismos en estudio.

CUESTIONARIO
Agar Manitol Salt
A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Extracto de carne bovina 1,0 g
Digerido pancretico de casena 5,0 g
Digerido pptico de tejido animal 5,0 g
Cloruro sdico 75,0 g
D-manitol 10,0 g
Rojo fenol 0,025 g
Agar 15,0 g
Si es necesario, ajustar el pH a 7,4 +/- 0,2
B) Forma de preparacin
Suspender 111 g de medio deshidratado en un litro de agua destilada. Mezclar
vigorosamente. Calentar agitando frecuentemente y dejar hervir durante 1
minuto para disolver completamente los ingredientes. Esterilizar a 121C
durante 15 minutos en el autoclave. Dejar enfriar hasta una temperatura entre
40-45C aproximadamente y verter en placas estriles. Dejar solidificar a
temperatura ambiente antes de su utilizacin.
C) Microorganismos que crecen en el medio
Se utiliza para la el aislamiento selectivo de estafilococos positivos a la
coagulasa como por ejemplo Staphylococcus aureus, esto quiere decir que
detecta bacterias gram positivas.
D) Agente inhibidor
Cloruro sdico al 7,5%
Agar Baird Parker
A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Bacto Tryptone 10,0 g
Bacto Beef Extract 5,0 g
Bacto Yeast Extract 1,0 g
Cloruro de litio 5,0 g
Glicina 12,0 g
Piruvato sdico 10,0 g
Telurito potsico 0,1 g
Agar 20,0 g
Emulsin de yema de huevo 50,0 ml
Si es necesario, ajustar el pH a 6,8 +/- 0,2
B) Forma de preparacin
Agregar los ingredientes en el agua destilada. Calentar agitando
frecuentemente y dejar hervir durante 1 minuto para disolver completamente.
Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar entre 45C y 50C
y agregar 10 ml de solucin de telurito de potasio al 1% esterilizado por filtracin
y 50 ml de una emulsin de yema de huevo. Para preparar la emulsin de yema
de huevo se debe desinfectar la superficie de la cscara, romperla y separar las
yemas de la clara sin destruirla luego colocarla en un cilindro graduado estril y
diluir al 50% en solucin salina estril. Las placas preparadas deben ser
utilizadas dentro de las siguientes 24 horas. Las colonias tpicas del
Staphylococcus aureus son pequeas, negras, rodeadas de una zona clara.
C) Microorganismos que crecen en el medio
Se utiliza para la el aislamiento selectivo de Staphylococcus aureus. Los
estafilococos producen colonias de color de gris oscuro a negro debido a la
reduccin del telurito.
D) Agente inhibidor
La glicina, el cloruro de litio y el telurito potsico actan como agentes
selectivos.
Agar Salmonella shigella
A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Extracto de carne bovina 5,0 g
Digerido pancretico de casena 2,5 g
Digerido pptico de tejido animal 2,5 g
Lactosa 10,0 g
Sales biliares 8,5 g
Citrato sdico 8,5 g
Tiosulfato sdico 8,5 g
Citrato frrico 1,0 g
Rojo neutro 0,025 g
Agar 13,5 g
Verde brillante 0,330 mg
Si es necesario, ajustar el pH a 7,2 +/- 0,2
B) Forma de preparacin
Segn loa laboratorios Britania se suspende 60 gramos del polvo ya preparado
en un litro de agua purificada. Se mezcla 5 minutos y luego se mezcla para
homogenizar. Calentar con agitacin frecuente y llevar a ebullicin durante un
minuto para su disolucin total. No es necesario esterilizar en autoclave.
C) Microorganismos que crecen en el medio
Salmonella y Shigella
D) Agente inhibidor
Sales biliares, verde brillante y citratos.

Agar hierro tres azucares


A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Digerido pancretico de casena 10,0 g
Digerido pptico de tejido animal 10,0 g
Cloruro sdico 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Glucosa 1,0 g
Sulfato ferroso de amonio 0,2 g
Tiosulfato sdico 0,2 g
Rojo fenol 0,025 g
Agar 13,0 g
Si es necesario, ajustar el pH a 7,3 +/- 0,2
B) Forma de preparacin
Disuelva con agua destilada, caliente hasta ebullicin, reparta en tubos y
esterilice en autoclave por 15 minutos a 121C. En este medio la concentracin
de glucosa es la dcima parte de la concentracin de la lactosa y la sacarosa.
C) Microorganismos que crecen en el medio
Escherichia coli (Colonias amarillas), Klebsiella/Enterobacter, Shigella y
Salmonella (Colonias rosas, Enterococcus.

Agar lisina hierro


A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Peptona de gelatina 5 g
Extracto de levadura 3 g
Glucosa 1 g
Lisina 10 g
Citrato de hierro y amonio 0.5 g
Tiosulfato de sodio 0.04 g
Purpura de bromocresol 0.02 g
Agar 15 g
Si es necesario, ajustar el pH a 6,7 +/- 0,2

B) Forma de preparacin
Suspender 35 g del polvo en un litro de agua purificada. Reposar por 5 minutos.
Calentar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucin
completa. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15
minutos. Enfriar y solidificar en posicin inclinada. (Britanialab.com)
C) Microorganismos que crecen en el medio
Salmonella spp.
Caldo Selenito
A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Peptona 5 g
Lactosa 4 g
Fosfato de sodio 10 g
Selenito de sodio 4 g
Si es necesario, ajustar el pH a 7,0 +/- 0,2

B) Forma de preparacin
Suspender 23 gramos del polvo en un litro de agua purificada. Mezclar bien y
calentar ligeramente hasta su disolucin completa. Evite el calentamiento
excesivo. No esterilizar en autoclave.
C) Microorganismos que crecen en el medio
Salmonella spp. a partir de muestras de heces y orina.
Agar Bismuto sulfito
A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Extracto de carne 5,0 g
Digerido pancretico de casena 5,0 g
Digerido pptico de tejido animal 5,0 g
Dextrosa 5,0 g
Fosfato de sodio 4,0 g
Sulfato ferroso 300,0 mg
Indicador de sulfito de bismuto 8,0 g
Agar 20,0 g
Verde brillante 25,0 mg
Si es necesario, ajustar el pH a 7,5 +/- 0,2

B) Forma de preparacin
Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar agitando
frecuentemente y dejar hervir no ms de 1 a 2 minutos. Evitar el
sobrecalentamiento. Enfriar a 45C, mezclar suavemente para que se disperse
el precipitado, colocar 20 ml de medio por cada placa y dejar solidificar. No se
esteriliza en autoclave por lo tanto debe utilizarse el mismo da de su
preparacin.
C) Microorganismos que crecen en el medio
Sallmonella thiphy
D) Agente inhibidor
El indicador de Bismuto sulfito y el verde Brillante son inhibidores de bacterias
Gram positivas y de algunas bacterias del grupo coliformes. (condalab.com)

Caldo Tetrationato
A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Digerido pancretico de casena 2,5 g
Digerido pptico de tejido animal 2,5 g
Sales biliares 1,0 g
Carbonato de calcio 10,0 g
Tiosulfato de sodio 30,0 g
Si es necesario, ajustar el pH a 8,4 +/- 0,2
B) Forma de preparacin
Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar agitando
frecuentemente y dejar hervir. Enfriar por debajo de 60C y aadir 2 ml de
solucin de yodo en 20 ml de agua destilada. Una vez que se aade el yodo el
medio no se puede calentar. Distribuir y enfriar a temperatura ambiente antes
de su utilizacin.
C) Microorganismos que crecen en el medio
Salmonella spp.

Caldo lactosa, verde brillante bilis (caldo BRILA)


A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Bilis de Buey deshidratada 20 g
Lactosa 10 g
Peptona 10 g
Verde brillante 0,0133 g
Si es necesario, ajustar el pH a 7,2 +/- 0,2

B) Forma de preparacin
Suspender 40 g del polvo en un litro de agua purificada. Disolver y distribuir 10
ml por tubo. Calentar a 100C durante 30 minutos. No es necesario esterilizar
en autoclave.
C) Microorganismos que crecen en el medio
Coliformes
Caldo Escherichia coli
A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Triptena 20 g
Lactosa 5 g
Sales biliares 1,9 g
Fosfato dipotsico 4 g
Fosfato monopotsico 1,5 g
Cloruro de sodio 5g
Si es necesario, ajustar el pH a 6,9 +/- 0,2

B) Forma de preparacin
Suspender 37,4 g del medio en un litro de agua destilada. Calentar hasta su
total disolucin. Distribuir en tubos de ensayo que contengan campanitas de
Durham. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C. (britanialab.com)
C) Microorganismos que crecen en el medio
Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium, Escherichia coli.
D) Agente inhibidor
Sales Biliares
Agar Tiosulfato Citrato bilis sacarosa
A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Extracto de levadura 5 g
Peptona de carne 5 g
Triptena 5 g
Citrato de sodio 10 g
Tiosulfato de sodio 10 g
Bilis de buey 8 g
Sacarosa 20 g
Cloruro de sodio 10 g
Citrato frrico 1 g
Azul de bromotimol 0.04 g
Azul de timol 0.04 g
Agar 15 g
Si es necesario, ajustar el pH a 8,6 +/- 0,2
B) Forma de preparacin
Suspender 89 g del polvo en un litro de agua purificada. Dejar reposar 5
minutos. Calentar con agitacin frecuente y llevar a ebullicin para disolucin
total. No es necesario esterilizar en autoclave. (britanialab.com)
C) Microorganismos que crecen en el medio
Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus.
D) Agente inhibidor
Bilis de buey, el citrato de sodio y el pH alcalino.
Caldo Laurel sulfato triptosa
A) Ingredientes para la preparacin por un litro de agua destilada:
Triptosa
Cloruro de sodio
Lactosa
Lauril sulfato de sodio
Fosfato dipotsico
Fosfato monopotsico
Si es necesario, ajustar el pH a 6,8 +/- 0,2
B) Forma de preparacin
Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos.
Calentar a ebullicin hasta la disolucin total. Distribuir en tubos conteniendo
tubos de fermentacin. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.
C) Microorganismos que crecen en el medio
Coliformes
D) Agente inhibidor
Lauril sulfato de sodio

BIBLIOGRAFA
Manitol Salt Agar. Manual DifcoTM. Becton Dickinson France SA.
Disponible en https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8771
Agar Baird Parket. Manual DifcoTM. Becton Dickinson France SA.
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https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/HB/CE/PA/ES-PA-
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Agar Salmonella Shigella. Manual DifcoTM. Becton Dickinson France SA.
Disponible en http://www.bd.com/resource.aspx?idx=8779
BD Triple Sugar Iron Agar (TSI Agar). Manual DifcoTM. Becton Dickinson
France SA. Disponible en
https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/HB/CE/PA/ES-PA-
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BD Caldo Tetrationato. Manual DifcoTM. Becton Dickinson France SA.
Disponible en http://www.bd.com/europe/regulatory/assets/ifu/hb/ce/ba/es-
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http://www.britanialab.com/productos/B02138%20REV%2001-
SALMONELLA%20SHIGELLA%20AGAR.pdf
Laboratorios Britania S.A. Verde Brillante Bilis. Caba, Argentina. Disponible
en http://www.britanialab.com/productos/B02107%20REV%2001-
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Laboratorios Britania S.A. Caldo Selenito. Caba, Argentina. Disponible en
http://www.britanialab.com/productos/B02120%20REV%2001-
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Laboratorios Britania S.A. T.C.B.S. medio. Caba, Argentina. Disponible en
http://www.britanialab.com/productos/B02167%20REV%2001-
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Laboratorios Conda S.A. Agar Bismuto Sulfito. Madrid, Espaa. Disponible
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http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm
Yousef, A. & Carlstrom, C. c2003. Microbiologa de los alimentos: Manual de
Laboratorio. Trad. J Wiley e Hijos. Primera edicin (espaol). Zaragoza
(Espaa), Editorial Acribia, S. A.