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MEDIOS DE CULTIVO

BACTERIANO
OBJETIVOS CONCRETOS DE LA PRCTICA
1. Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes
para el desarrollo de los microorganismos in vitro.
2. Manejar los instrumentos de uso rutinario,
imprescindibles, en el laboratorio de microbiologa.

la

vez

que

3. Hacer
un
primer
acercamiento
a
la
manipulacin
de
microorganismos. Adquirir la idea de la importancia del trabajo en
condiciones de esterilidad y las tcnicas ms comunes para realizarlo.

FUNDAMENTO

El medio de cultivo
para
el

necesidades
crecen
necesitan

el

constituye el aporte de nutrientes indispensables


crecimiento
de
los
microorganismos. La
composicin precisa depender de la especie
que se quiera cultivar, porque las
nutricionales varan considerablemente. Hay
microorganismos muy poco exigentes que
bien en medios de laboratorio normales y
microorganismos
muy
exigentes
que
determinadas sustancias como vitaminas,
suero o sangre para crecer.

Existen medios cuya composicin permite


crecimiento de:
1. un gran nmero de especies (agar nutritivo, caldo ordinario,
agar de Sabouraud),
2. determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de
otros), son los denominados medios selectivos.
3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de
determinadas pruebas fisiolgicas o test bioqumicos (utilizacin
de citratos, acidificacin a partir de azcares, etc.).

Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:


1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua,
nutrientes orgnicos (hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas,
etc) y nutrientes inorgnicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)
2. Alternativos:
sustancias
isosmotizantes
(NaCl), agente
solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.

Durante las prcticas se van a manejar medios de cultivo de


composicin muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a
consistencia: medios slidos, semislidos y lquidos. Este ltimo aspecto
es importante a la hora de la preparacin de los mismos. Aunque los
medios artificiales o sintticos se pueden preparar a partir de sus
componentes individuales, se pueden adquirir comercialmente como
medios deshidratados a los que solamente hay que aadir la cantidad de
agua necesaria. El fabricante indica la composicin, la caducidad, y la
cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe
esterilizarse.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO


Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de
los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000
medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura,
grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado
correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de
todo microorganismo contaminante.
La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos
similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano.
Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de
estractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.

El gar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin


de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas
excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es
atacado por aquellas que crecen en l.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya
que bastantes bacterias provocan su licuacin.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales
de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa,
bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para
detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que
ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para
promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para
detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del
crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como
indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta
de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la
mayoria de las bacterias Gram-positivas).

CONDICIONES PARA EL MEJOR FUNCIONAMIENTO


DEL MEDIO DE CULTIVO
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo
se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en
algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.
1- disponibilidad de nutrientes adecuados
2- consistencia adecuada del medio
3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases
4- condiciones adecuadas de humedad
5- Luz ambiental
6- pH
7- Temperatura

8- Esterilidad del medio

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO


Atendiendo a su estado fsico:

Lquidos
Semislidos
Slidos

Atendiendo a su utilidad prctica:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia


variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn
enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina,
FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento
de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)
Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se
aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de
bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando
las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad
(Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)
Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora
competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado
(Selenito, medio con Vitamina K).
Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas
especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de
bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein).
Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las
peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo)
especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados
se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria
(Oxidacin-Fermentacin)

MEDIOS DE CULTIVO DE USO HABITUAL

AGAR SANGRE : Medio enriquecido, estndar


AGAR POLIVITEX (chocolate) : Medio enriquecido, para bacterias
que no crecen en medios habituales y para atmsfera de CO2
MAC CONKEY : Selectivo para BGN. Lactosa+indicador
MULLER-HINTON : medio slido estndar para antibiogramas con
discos y por difusin

MULLER-HINTON/SANGRE: ATB bacterias que requieran sangre


(Neumo. Strepto)
MULLER-HINTON/CHOCO : ATB microorganismos que requieran
Factores (Haemophilus)
THAYER-MARTIN: selectivo Neisserias patg. (N. lactamica,
Gono/Meningo) para atmsfera de CO2
OXIDACION/FERMENTACION (GLUCOSA) : Estudio de utilizacin de
Glucosa por los BGN
TREE SUGAR-IRON : tubo en pico flauta (base larga, pico corto),
para estudiar Oxid/Ferm de Gluc-Lact-Sac, produccin gas y SH2
TIOGLICOLATO : Medio lquido
SCHAEDLER: medio bsico enriquecido con sangre. Para ANA
KANA-VANCO: Con Kanamicina y Vancomicina. Selectivo para
Bacteorides y otros BGN anaerobios. Para atmsfera ANA
BBE: Bacteroides Bilis Esculina. Selectivo para Bacteorides. Para
atmsfera ANA
SABOURAUD : Cultivo de hongos (incubar a T ambiente y a 37 gC)
SAB + Cloranfenicol y Actidione : Selectivo hongos patgenos
CZAPEK: Medio para Hongos. Identificacin de Aspergillus
SALMONELLA-SHIGELLA : medio altamente selectivo para
Salmonella y Shigella
XLD : Selectivo Salmonella y Shigella
SELENITO : Medio lquido de enriquecimiento selectivo para
Salmonella-Shigella
CIN : Selectivo Yersinia
CLED: Medio de recuento urinario. Indicador de fermentacin de
Lactosa
GARDNERELLA: Selectivo Gardnerella vaginalis. Contiene sangre
humana para valorar hemlisis
CAMPY : Cultivo de Campylobacter

PREPARACION DEL AGAR AGAR


1. Calculamos la cantidad requerida a travs de una regla de 3
simple usando el equivalente dado en las instrucciones del frasco
1000mL ---------- 17.5g
72mL
---------- Xg
X= (17.5*72) / 1000

X= 1.26g
2. En la balanza calcular el peso de un trozo de papel aluminio,
posteriormente sumarle a su peso 1.26g del Agar Agar y volver a
pesar
3. Medir 72mL de agua destilada en una probeta
4. Verter el agar agar en un matraz y agregar el agua destilada de a
poco para disolver el agar agar mientras calentamos la solucin
5. Colocar un tampn de algodn al matraz y cubrir con papel
6. Llevar la solucin sellada y cubierta al autoclave para su
esterilizacin

CUESTIONARIO

Qu es agar? De donde se extrae?


Es una gelatina vegetal de origen marino. Es un polisacrido sin ramificaciones
obtenido de la pared celular de varias especies de algas

Qu es gelatina? De donde se extrae?


La gelatina es una protena compleja que al estar en estado puro
posee la propiedad nutritiva: protena (84-90%), sales minerales
(1-2%) y agua (el resto); se obtiene a partir del colgeno procedente del tejido
conectivo de animales hervidos con agua.

Porque se utiliza agua destilada en la preparacin de los


medios de cultivo?
Para evitar la contaminacin por otras bacterias o iones no
deseados

Elabora una tabla indicando el medio de cultivo, tipo de


medio, azcar fermentable, sistema indicador

Medio
Medio con cisteina
y lactosa, deficiente

Sustancias
selectivas
Ninguna

Sistema diferencial

Utilizacin

Lactosa
Azul de bromotimol

Medio diferencial sin actividad selectiva. Permite


el crecimiento de todas las enterobacterias.

en electrolitos
(CLED)

Proteus no invade.
Se utiliza para aislamiento general de
enterobacterias (orinas y otros productos).

Agar eosina-azul de Eosina


metileno (EMB)
Azul de
metileno

Agar Mac Conkey

Lactosa
Sacarosa
Los colorantes son
reveladores del sistema
diferencial

Sales biliares Lactosa


Cristal violeta Rojo neutro

Poco inhibidor. Permite el crecimiento de


enterobacterias y enterococos. Diferencia E. coli
de otras lactosa positivas.
Posee gran carcter diferencial para Candida y
actinomicetales aerobios.
Poco inhibidor. Permite el crecimiento de
enterobacterias y enterococo.

Agar xilosa-lisina
Desoxicolato
desoxicolato (XLD) sdic

Tiosufalto sdico
Se utiliza para el aislamiento de shigelas y
Citrato frrico amnico samonelas. Posee buen carcter diferencial para
estas enterobacterias.
Lisina
Xilosa, lactosa,
sacarosa

Medio de Hektoen

Citrato frrico amnico Permite el crecimiento de salmonelas y shigelas.

Sales biliares
Desoxicolato
sdico

Tiosulfato sdico
Lactosa, sacarosa,
salicina
Azul de bromotimol
Indicador de Andrade

Agar salmonelashigela
(SS)

Sales biliares Tiosulfato sdico


Verde
Citrato frrico
brillante
Lactosa, rojo neutro
Citrato sdico

Permite el crecimiento selectivo de salmonelas,


shigelas y yersinias

Agar Verde
Brillante

Verde
brillante

Lactosa, sacarosa
Rojo fenol

Permite el crecimiento de salmonelas.

Medio de Wilson
Blair

Verde
brillante
Sulfito de
bismuto

Sulfito ferroso

Est indicado para el aislamiento de S. typhi

Agar cefsulodinirgasan
Novobiocina
(CIN)

Desoxicolato Manitol
Cefsulodin
Rojo neutro
Irgasan
Novobiocina
Cristal violeta

Es altamente selectivo para Yersinia


yAeromonas.

Caldo selenito
(Medio de
enriquecimiento)

Selenito
sdico

Enriquecimiento de salmonelas.

Caldo tetrationato
(Medio de
enriquecimiento)

Sales biliares
Tetrationato
sdico

Enriquecimiento de salmonelas.

Medio de cultivo

Tipo de medio

Agente bacteriosttico

Azcar
fermentable

Sistema Indicador

ALRF (agar lactosa rojo


fenol)

diferencial (no
selectivo)

-----

lactosa

rojo fenol

Agar Cetrimide

selectivo

bromuro de cetiltrimetil
amonio

-----

-----

Agar Mac Conkey

selectivo y
diferencial

cristal violeta, sales


biliares

lactosa

rojo neutro

VRBA (violeta rojo bilis


agar)

selectivo y
diferencial

cristal violeta, sales


biliares

lactosa

rojo neutro

Manitol Salt Agar (Chapman) selectivo y


diferencial

cloruro de sodio

manitol

rojo fenol

XLD agar (xilosa lisina


desoxicolato)

selectivo y
diferencial

desoxicolato de sodio

lactosa, xilosa,
sacarosa

rojo fenol, citrato frrico amnico


y tiosulfato de sodio

BiS agar (bismuto sulfito)

selectivo y
diferencial

verde brillante, sulfito de


bismuto

glucosa

indicador de sulfito de Bi y sulfato


ferroso

Baird Parker agar

selectivo y
diferencial

Cloruro de litio y telurito


de potasio

------

yema de huevo, telurito de potasio

TSB + 10% NaCl

enriquecimiento
selectivo

cloruro de sodio

------

------

Caldo Tetrationato

enriquecimiento
selectivo

Tetrationato, sales biliares ------

------

CLBVB (caldo lactosa bilis


verde brillante)

enriquecimiento
selectivo

verde brillante, sales


biliares

produccin de gas

lactosa