Objetivos

Preparacin de medios de cultivo

Curso: Mtodos en fitopatologa Dr. Pedro Mondino
24 de abril de 2009

Conocer a que denominamos medio de

cultivo en el laboratorio de Fitopatologa. Reconocer la existencia de diferentes tipos de medio. Reconocer la utilidad de los diferentes medios de cultivo en el trabajo con patgenos de plantas.

Objetivos
El alumno debe:

Medios de cultivo
Los medios de cultivo de microorganismos

1) ser capaz de elaborar medios de cultivo con el fin de ser utilizados posteriormente para el aislamiento de hongos, bacterias o microorganismos epifticos. 2) Desenvolverse con soltura en la utilizacin de protocolos.

(hongos, bacterias, levaduras) son esenciales en el Laboratorio de Fitopatologa por lo que a diario se preparan y utilizan. Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos.

Condiciones que debe reunir un Medio de cultivo

Para

Disponibilidad de nutrientes en los Medios de cultivo.

Un medio de cultivo para que permita el crecimiento

que los microorganismos crezcan adecuadamente, un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones:
contener los nutrientes y factores de crecimiento

necesarios disponer de oxgeno temperatura adecuada humedad pH. exento de microorganismos contaminantes.

adecuado de microorganismos debe contener como mnimo: Carbono Nitrgeno Azufre Fsforo Sales inorgnicas que suplan iones (K, Mg, Fe, Ca, etc.).

Disponibilidad de nutrientes en los Medios de cultivo

Estos nutrientes generalmente se aportan con

Medios de cultivo segn su composicin

Medios Naturales. Consisten nicamente en un

Extracto de malta, Peptona, Papa, extracto de levadura, etc.

material vegetal. Ejemplos: un trozo de papa. Agar jugo de manzana, Agar durazno, Agar y jugo de vegetales.

Medios de cultivo segn su composicin

Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una

Medios de cultivo segn su composicin

Medios complejos o de composicin

composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin. Ej: Medio Czapek. Nitrato de Sodio 2 g/l Fosfato bipotsico 1 g/l Cloruro de potasio 0,5 g/l Sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g/l Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/l Sacarosa 30 g/l Agar-agar 15 g/l

indefinida: Son medios cuya composicin no se conoce con exactitud. contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. Ej: Agar Papa; Agar Malta;

Medios complejos
Agar Papa Dextrosa: Medio para el cultivo y conteo de levaduras y

Medios de cultivo segn su estado fsico

Los medios de cultivo utilizados pueden ser de

hongos en general. Agar -15g Dextrosa - 20g Infusin papa - 4g Agua destilada 1L

diferentes tipos: Medios slidos. Medio semislidos. Medios lquidos.

Medios de cultivo

Medios slidos de cultivo

Usualmente para preparar un medio slido se parte

de un medio lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar El agar es un polisacrido extrado de algas. En los medios slidos la proporcin de Agar es siempre por encima del 15%

Medios de cultivo
El agar es el elemento solidificante ms

Medios semi-slidos de cultivo

En los medios semi-slidos la proporcin de Agar es

empleado en la preparacin de medios de cultivo. Sus caractersticas principales son:

de alrededor del 5%

Se licua completamente a temperaturas de 80 100 C y se solidifica al enfriarse a 40 grados. No afecta el crecimiento de hongos ni bacterias. No es utilizado por los microorganismos que crecen en l.

Medio Agar Agua

Se trata de un medio sin el agregado de nutriente

Medios de cultivo
En ocasiones se aaden al medio de cultivo sustancias

alguno.
Utilidad

indicadoras de actividades metablicas. Tambin se pueden aadir sustancias que ejercen accin inhibitoria selectiva de ciertos microorganismos.

Aislamiento de hongos a partir de tejido vegetal. Se logra que el crecimiento sea el resultado de la nutricin que posee el tejido vegetal. Ensayos de evaluacin de actividad antifngica.

Medios de cultivo
La exactitud en los procedimientos de

Medios de cultivo segn su utilidad prctica

Generales: Sirven para el cultivo de una gran variedad

fabricacin, preparacin, conservacin y uso, de los medios de cultivo asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos en los ensayos o experimentos.

de microorganismos. Ej: Agar Papa destrosado (PDA); Agar Nutriente (NA) Selectivos: Son medios a los que se les agregan sustancias para inhibir el crecimiento de otros microorganismos. Ej: Agar Malta acidificado y con antibitico para inhibir el crecimiento de bacterias. Diferenciales:

Medios de cultivo segn su utilidad prctica

Medios diferenciales: Son aquellos destinados a

Medios de cultivo segn su utilidad prctica

Medios selectivos: Son aquellos que

facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.

favorecen por su diseo el crecimiento especfico de un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta

Temperaturas de incubacin
En general los microorganismos patgenos de

Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el

plantas crecen a temperaturas en el entorno de 24 a 28 C. En ocasiones incubamos a temperaturas diferentes:

A 37 C cuando queremos descartar el crecimiento de agentes de control biolgico a la temperatura del cuerpo humano. A 5C o menos cuando buscamos microorganismos adaptados a crecer en la cmara frigorfica. Venturia inaequalis debe incubarse a temperaturas de entre 16 y 20 C

medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas de los cultivos microbianos. En las estufas de cultivo se debe proporcionar una fuente adecuada de humedad para evitar as que se deseque el medio.

Presencia de oxgeno
Los microorganismos aerobios necesitan que el

Presencia de oxgeno
Los microorganismos aerobios necesitan que el oxgeno

oxgeno llegue en forma adecuada al medio.

En los medios lquidos se recurre a la agitacin, de lo contrario solamente habr crecimiento en la parte superior.

llegue en forma adecuada al medio. Los anaerobios por el contrario crecen en ausencia de oxgeno. Ej. Erwinia

Preparacin de medio Agar Malta con antibitico

Receta del agar malta
Extracto Agar

Preparacin de medio Agar Nutriente

de malta 20 g/L. 20 g/L pH = 5,4 Sulfato de estreptomicina al 0,02% (0,1 ml de la solucin stock/100 ml de medio).

Receta NAD (Nutriente agar destrosa)

Agar

nutriente 23g 5g Agua destilada 1000 ml.

Destrosa

Preparacin de medio Agar Nutriente

3 g de extracto de Carne de buey 5 g de peptona trpsica de gelatina 15 g de agar de cloruro sdico y glucosa agua destilada hasta 1000 ml

Esterilidad de los Medios de cultivo

Los medios de cultivo han de estar perfectamente

estriles para evitar otros microorganismos puedan interferir con el crecimiento del que queremos cultivar. Los medios de cultivo se esterilizan en el autoclave.

Medios de cultivo
En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri,

Medios de cultivo
Los medios se pueden utilizar en frascos,

comienza a utilizar placas de vidrio planas Hoy existen de plstico. Procedimiento seguido para dispensar el medio en placas de Petri

placas de Petri o tubos.