Técnicas de Biología Molecular

Purificación de proteínas
 Las proteínas son separadas y purificadas por la diferencia en sus propiedades
 Pueden ser precipitadas por cambios en el pH ,T y por la adición de ciertas sales.
 Tipos de cromatografía:
o intercambio de iones
o exclusión de tamaño
o afinidad
o líquida de alta eficacia (HPLC)

Electroforesis: separa proteínas dependiendo de su masa o su carga

 La electroforesis en SDS y con un enfoque isoeléctrico puede usarse de manera separada o en combinación
para mayor resolución

 Todos los métodos de purificación requieren de un método de cuantificación de la proteína de interés en

presencia de otras proteínas

Aislamiento de DNA y RNA

1. Extracción: lisis celular

a. Métodos químicos
i. Sodio dodecilo sulfato (SDS): degrada la membrana celular capturando lípidos y
proteínas

ii. EDTA: molécula quelante, su forma desprotonada se une al Mg2+. Funciona como
cofactor de las nucleasas, evitando que degraden al DNA.

iii. NaCl: forma una capa iónica alrededor del DNA que lo protege , evitando su
degradación.

iv. Tris (HCl): solucione butler que mantiene el pH entre 7.5 – 8.2

v. Proteinasa K: degradan proteínas ayudando a purificar aún más el DNA

b. Métodos físicos
i. Homogeneización mecánica: mortero

ii. Sonificación

c. Métodos enzimáticos
i. Proteasas: rompen los enlaces peptídicos de las proteínas de la membrana plasmática y
las interacciones célula-célula

2. Purificación: eliminación de proteinas y lípidos de membrana.

a. Solventes orgánicos: Fenol

 b. Centrifugación: se recupera el sobrenadante

c. Cloroformo

3. Precipitación
a. Etanol

b. Centrifugación
Biblioteca Genómica

 Representación de todo el DNA genómico de un organismo , incluyendo regiones codificantes y no

codificantes por igual.
 Pasos básicos para hacer una biblioteca de DNA :
o Preparación de fragmentos de DNA representativos
o Preparación del vector apropiado
o Clonación y transformación
o Selección y screening
Southern Blot

 Permite estudiar una secuencia de DNA especifica

 Procedimiento
1. Se digiere el DNA purificado con una enzima de restricción.
2. Los fragmentos de DNA se separan mediante corriente eléctrica para se desplacen a través de un gel
↳los fragmentos mas pequeños se deslizan más rápido
3. Los fragmento de DNA se transfieren del gel a una membrana sólida
4. Marcación : la membrana sólida se expone a una sonda de DNA marcada con una sustancia radioactiva
o fluorescente
↳Esto permite que los fragmentos de DNA que contienen secuencias complementarios a la
secuencia de DNA sonda , sean visualizados
Northen Blot

 Permite estudiar el RNA

 Procedimiento : lo mismo que Southernblot pero con RNA
Proteínas recombinantes
 Son aquellas que se obtienen al expresar un gen clonado en una especie o una línea celular distinta a la
célula original.

 A nivel industrial la producción involucra:

o Fermentación: bacterias son cultivadas en fermentadores que contienen un medio de cultivo
nutritivo.
o Extracción: células son centrifugado para recuperar las proteínas en su interior .
o Purificación: se separa la proteína recombinante de otras proteinas bacterianas .
o Formulación: la proteina recombinante es modificada para conseguir una forma estable y estéril que
puede administrarse terapéuticamenteç

PCR
 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite la producción
(amplificación) rápida de millones a miles de millones de un segmento específico de ADN, que así se podrá
estudiar en mayor detalle.
 Implica el uso de fragmentos cortos de ADN sintético, denominados cebadores, para seleccionar un
segmento del genoma que se amplificará, y luego múltiples sesiones de síntesis de ADN para amplificar ese
segmento.