Biotecnología molecular

UNIDAD 1: MÉTODOS BÁSICOS DE

MANIPULACION DE ACIDOS NUCLEICOS Y
TECNICAS DE ANÁLISIS
Extracción y purificación de ácidos nucleicos
Es fundamental purificar el laboratorio primero, de
manera que haya un ambiente libre de nucleasas
para evitar la degradación. Se encuentran tres etapas para la extracción y
purificación de ácidos nucleicos.
La extracción se refiere a tomar una célula y
romperla, de forma que los ácidos nucleicos salen.

1) Extracción: lisis celular con inactivación

de nucleasas
2) Clarificación: centrifugar para poder
retirar y quede opaco. Así ira al fondo. Se
Luego, es necesaria la purificación ya que hay
deben filtrar los sólidos de los liquido.
interferentes (nucleasas o carbohidratos) que
Separa los sedimientos que opacan la
inhiben las enzimas que se usan en ingeniería
solución.
genética. De manera que purificar sirve para que
3) Purificación: eliminación de proteínas, AN
las enzimas funcionen lo mejor posible,
no deseados, lípidos, carbohidratos,
manteniendo la integridad de los ácidos nucleicos.
sales y compuestos orgánicos.
Los factores para considerar son variados;

 tipo de célula (tiene pared celular) de

1) Método de lisis para extracción de AN
manera que se puede saber que tan
drástico tiene que ser el proceso.
 Es una célula aislada o en tejido, de
manera que el ADN estará mas integro o
menos.
 Ambiente (cultivos puros o muestras
ambientales)
 Contaminantes (carbohidratos, por
ejemplo)
 Tipo de acido nucleico; RNA o DNA
 Rendimiento y pureza necesarios,
mientras más haya, el rendimiento será
mejor
De los métodos mecánicos se caracterizan por
fuerzas corte que rompen la célula.

 Homogenización, el cual mezcla con

aspas para romper la célula. Dentro de
 este mismo tipo, se encuentra el Potter
Elvehjem, el cual aplasta y la prensa
francesa que es más grande.
 Microfluidizador: el líquido con las células
es repartido entre dos o más corrientes
que se bombean a elevadas presiones
con alta velocidad. Al caer la presión se
rompen las células.
 El ultrasonido forma burbujas con micro
presiones y va a implosionar las
burbujas, rompiendo consigo las células.
Esto ocurre por alta frecuencia que
produce cavitación, flujo de líquidos a
alta velocidad y fuerzas de roce.
 El molino de bolas tiene bolas de vidrio o
acrílico de manera que tiene menos
material que pueda intervenir en el
proceso que golpean las células con
liquido y sal para ajustar el pH.
Es importante la temperatura para no desnaturar
el DNA, este método requiere mucha energía y
que genera a su vez calor, además de ser
inespecíficos y pueden dañar el DNA. Es por esto
por lo que muchas veces se utiliza refrigerante
Dentro de los no mecánicos de encuentran
 Los detergentes: SDS que tiene un lado
polar similar a la bicapa lipídica, por lo
que tiene afinidad y se cuela entre la
membrana, rompiéndola. Son histonas-
micelios que envuelven la membrana
celular.
 Los solventes orgánicos (tolueno,
cloroformo): permeabilizan las
membranas celulares, disolviendo
componentes hidrofóbicos de las
paredes, como por ejemplo los
fosfolípidos de membrana interna en
Gram -.
 Los agentes caotrópicos (urea,
guanidina): interfieren con los enlaces no
covalentes como los puentes de H,
destructurando el agua
 EDTA: captura el magnesio por medio de
la afinidad que tiene su estructura con
este. Esto hace una interferencia en las
enzimas como las polimerasas por ser
un cofactor de las nucleasas. Se debe
agregar NaOH para solubilizar. Casi
todos los buffer contienen EDTA
También se puede usar enzimas que son capaces
de romper componentes. La lisozima, hidroliza las
uniones beta 1,4 entre los residuos de ácido N-
acetil murámico y N-acetil-D-glucosamina en un
peptidoglicano de pared celular de bacterias Gram
+. La enzima liticasa rompe enlaces beta-1.3 de
glucano de levaduras y hongos. Por ultimo las
proteasas se usan para todo tipo de célula sobre
todo para tejidos, pero se utilizan poco por ser
difíciles de sacar. Estas funcionan rompiendo
enlaces peptídicos de proteínas de la pared
celular y membrana plasmática e interacciones
célula-célula. Casi todas las enzimas que actúan
sobre AN necesitan iones magnesio. Las
desventajas de las enzimas para la lisis es que su
coste económico es mucho para procesos más
grandes, además de que las bacterias gran + son
mas susceptibles a lisozima por poseer acido N-
acetilmuramico.
La dificultad para romper las células:
  Fenol: es un solvente orgánico con anillo
aromático apolar (insoluble) que se va al
fondo por ser más pesado. Desnatara las
proteínas y causa su precipitación en la
interface fenol-agua y solubilización en
fenol. También logra separar los lípidos y
se trabaja la parte mas acuosa. Esto no
se usa mucho por ser toxico.

Para gran escala, los métodos químicos se evitan

por los costos y por la dificultad de sacarlos, al
igual que las proteínas por alergias. Por lo tanto,
 Salting out: al tener proteínas solubles, el
se prefieren métodos mecánicos. El método ideal,
agua se ubica alrededor, cuando
debe romper tejido mas resistente, debe ser
esterilizable, validable, automatizable, continuo, aumenta mucho la concentración de sal,
se dispersa el agua por la interacción con
contenible y económico.
las proteínas. Esto produce una
2) Clarificación: eliminación de restos interacción proteína-proteína.
celulares
Para poder manipular AN es necesario que estén
en estado puro, por lo que se separan
contaminantes (proteínas, lípidos, carbohidratos),
nucleasas (degradan los ácidos nucleicos) e
interferentes (inhibidores de enzimas de biología
molecular, como enzimas de restricción,
polimerasa, ligasa). Esta separación puede ser
mediante:

 Centrifugación
 Filtración  Etanol, haciendo que el OH interactúe
 Método mixto: enzimas + centrifugación con el agua y el DNA sea insoluble en el
solvente. Es por esto que precipitará el
DNA. Esto ocurre porque el DNA es
3) Purificación soluble en el agua pero no en alcohol
(por ser el etanol menos polar que el
agua).

 Cromatografía de intercambio iónico:
consiste en tener resina con carga
eléctrica + (lo que es opuesta al DNA).
Por lo tanto, el DNA se une a la resina,
se hace un lavado y luego se agua sal
para que compita con el DNA y suelte la
resina. Esto se realiza a 20ºC para que
las nucleasas no estén activadas,
registrando la absorbancia para saber
dependerá del tamaño del DNA.
 Cromatografía adsorción de DNA a silica.
Esta técnica cuenta con una silica con su
respectivo OH con una carga muy fuerte,
la cual se usa como caotropico y se
forma un puente salino que neutraliza la
carga. De manera que el DNA se unirá
según su tamaño. Luego la interacción se
suelta con agua.
Cuantificación de AN por espectrofotometría
Se genera por las mismas propiedades del DNA
(absorbe a 260 nm).
ABS = [X] * L * e
De esta manera se pude saber la concentración.
Con el espectrograma se sabe la longitud de
onda. Las proteínas tienen su máxima
absorbancia a 280nm, de manera que si en el
grafico se tiene ABS 260/ ABS 280
aproximadamente 1,8, entonces se tiene DNA
puro. Si es menor, no es puro y esta contaminado
con proteínas.
Mediante espectrofotometría (260/280 nm) se
evalúa la cantidad de DNA. Por otro lado, la
electroforesis se evalúa la cantidad de DNA y su
calidad.
PCR y aplicaciones
PCR es una técnica de varios tipos según lo que
se quiere hacer. Mediante una muestra de DNA,
se amplifica y se pueden detectar enfermedades,
vacunas. Con esta técnica se hace en menos
tiempo el fragmento de un gen, por lo que fue un
quiebre de paradigma.
Los elementos básicos para esta reacción son:
 DNA blanco: es el que se quiere
amplificar, debe estar libre de quelantes
(edta, fenol o detergentes) y ser lineal o
circular. Puede ser de hebra simple o
doble
 Partidores (primers): secuencias
complementarias a la región que quiero
amplificar se une en forma opuesta y
debe ser especifico a la región para que
no identifique otra. Debe tener 45-60%
 de C-G por lo menos para que tome  PCR Inverso: Se quiere amplificar todo lo
fuerza (mayor eficiencia y confianza). que no se conoce, lo que no es el gen,
También el extremo 3’ debe terminar en por lo que los partidores operan al revés.
C/G, se debe evitar la presencia de mas Es útil para la identificación de la
de 3 o mas G/C en los últimos 5 localización de un fragmento de DNA
nucleótidos del extremo 3’ insertado en un genoma.
 DNA polimerasa es la enzima que pone
los nucleótidos. Necesita que el extremo
3’ este libre.
 Deoxinucleotidos. En baja cantidad se
pueden agotar. Si hay en exceso, pueden
acomplejarse con el magnesio.
 MgCl2 cofactor de la enzima para que
funcione la polimerasa. Aumenta el
rendimiento, pero no debe estar en
exceso. Si no hay suficiente, hay bajo
rendimiento de producto alcanzado, si
hay exceso, induce la amplificación de
productor inespecíficos.
 Bufer: es una serie de sales que  Multiplex PCR es convencional, pero se
proporcionan a la polimerasa para hace con varias parejas de partidores al
trabajar, se mezcla todo acá. Provee un mismo tiempo en la reacción. De esta
ambiente optimo de pH, contiene tris, manera se puede detectar de que
HCl, KCl, MgCl2 y glicerol. especie (patógeno, forenses, génicas) es
 Termociclador: hace ciclos de un gen.
temperatura de forma que desnatura y
natura constantemente el DNA para su
duplicación
Tipos de PCR

 PCR clásico
 PCR Anidado: le da especificidad a lo
que se está amplificando, aumentando
las proporciones relativas, utilizando una
 PCR cuantitativo (qPCR): la gracia es ver
segunda pareja de partidores al interior
ciclo a ciclo lo que sucede por medio de
del fragmento de interés, sirve cuando
una fluorescencia ubicada en una región
hay genes repetidos.
5’. Se usan sondas en tiempo real.
 Digital PCR: técnica que detecta
fragmentos raros. Para esto se divide el
DNA y se hacen distintos PCR

 Epic PCR: Se usa para ecología
microbiana, permite detectar genes de
bacterias. vincula genes aislados con sus
propietarios, resolviendo el rol de células
individuales de genes con funcione
específicas. Se realiza por 16S del
ribosoma.
Técnicas de detección de ácidos nucleicos
Las técnicas que veremos han sido reemplazadas
por unas más modernas, las 3 funcionan con el
mismo proceso principal (hibridación). Se utiliza
para detectar isoformas, expresión de genes nº de
copias de un gen y detección in vivo (si un
transcrito se expresa).
La hibridación de sondas funciona como detección
de la presencia de ácidos nucleicos, realizando
una combinación antiparalela con dos moléculas;
una homogénea de secuencia conocida como
sonda y otra heterogénea desconocida que se
quiere analizar. La idea es formar heterodúplex
entre la sonda y el blanco.
La desaturación inicial es importante ya que es
necesario que se separen las hebras. Cuando se
reasocian, se pueden generar tres formas;
homoduplex (RNA o DNA) o heterodúplex.
La hibridación es una asociación y disociación de
DNA. La velocidad de Re asociación depende de
la concentración inicial de DNA y la temperatura,
encontrándose al azar las cadenas
complementarias y es proporcional al numero de
veces que se encuentra presente. Cuando se
tiene mucha concentración de DNA o RNA blanco,
el tiempo en que se forma el heterodúplex es
menor.
La estabilidad del dúplex (blanco y sonda) dificulta
la denaturación y depende de factores:
 Composición de bases en gran mayoría
GC es más difícil de separar
 Ambiente químico tiene cationes
monovalentes estabilizan el dúplex
 El largo del DNA, más largo será más
puentes de hidrogeno
La estabilidad se mide en Tm (temperatura de
melting). A medida que se calienta, se ve la
absorbancia y se abren las hebras cambiando la
densidad óptica.
La estrictez (stringency) es la probabilidad de que
se disocie la hebra doble o también conocida por
ser la capacidad de una molécula de hebra
simple, discrimine entre moléculas de mayor o
menor complementariedad para formar doble
hebra. Es decir, la estrictez es la capacidad que
tiene una molécula de doble hebra para
permanecer unida por la complementariedad de
sus bases la especificidad de dicha
complementariedad.
El objetivo final de hibridación de ácidos nucleicos
es generar las mejores condiciones para favorecer
la formación del heterodúplex. Esto se logra
controlando la estabilidad del dúplex y estrictez
del medio, manejando:
 Composición de secuencias CG,
mientras más, será más difícil es separar
 Complementariedad, cuando es
totalmente complementario, el
heterodúplex será más estable. Cuando
 no es total, el heterodúplex dependerá de
la estrictez
 Concentración de sales y formamida. Los
iones positivos en la solución reducen la
repulsión electroestática entre las cargas
negativas de los grupos fosfato. Cuando
aumentan los cationes Na+, contribuye a
estabilizar la unión entre hebras. Para el
caso de la formamida, esta desestabiliza
el DNA con una temperatura constante,
reduciendo Tm.
 pH. Cuando es menor a 5, el DNA es
propenso a que los enlaces fosfodiéster
se rompan, haciendo que se separen las
pares de bases del DNA. Si el pH es
mayor a 9, será propenso a tener
desnaturacion alcalina por la abundancia
de iones de hidróxido por romper los
puentes H
 Temperatura: cuando está a temperatura
ambiente se encuentra estable, pero si
esta es muy alta, se separarán y no se
unirán, sin formar el heterodúplex.
Cuando es muy baja, no se separará las
homoduplex. Por eso se trabaja a 20ºC
menos que la Tm.
Técnicas
1) Northen Blot
Es una técnica de hibridación donde el blanco
puede ser RNA o mRNA (hebra transcrita), por lo
que logra detectar transcripciones o variantes de
splicing. Primero se aísla el DNA y se purifica
hasta alcanzar RNA. Normalmente su utiliza
formamida para ayudar a separar.
Cuando se termina la electroforesis, se transfiere
y las sales del bufer hacen que se separe el RNA
y se pega al positivo. Se inmoviliza para fijar por
UV o calor haciendo que se pegue.
RNA debe estar integro para hacer esto. Para la
sonda (se sintetiza por PCR) uno de los
nucleótidos tiene fosforo radioactivo. Esto tiene la
gracia de que se puede hacer la radiografía y se
quema el film. Esto mostrará que tan estricto fue
el lavado. Por lo que es importante el lavado post
hibridación.
Los lavados post hibridación sirven para eliminar
heterodúplex no específicos que se pueden haber
formado.
2) Southern Blot
Es parecido, pero se hace en DNA para saber el
nº de un gen en un genoma y permite determinar
cambios en la estructura del DNA. Se utiliza para
la detección de mutaciones o de enfermedades
genéticas. También se usa para detección de
DNA en casos forenses.
Para esto se realizan cortes por enzimas de
restricción, fragmentando el DNA en pequeños
trozos que se ordenan por tamaño en una
electroforesis. Estos se trasfieren a una
membrana de nitrocelulosa para su desnaturacion
con fijación por medio de luz ultravioleta. Luego,
esto ya fragmentado y fijado se incuba con una
sonda marcada de DNA complementario.
3) Hibridación in-situ
Lo que se busca (blanco) es una molécula de
mRNA utilizando una sonda de DNA o RNA
complementario. Se realiza in vivo, es decir en un
tejido o organismo entero. La detección del
heterodúplex es indirecta.
La sonda de DNA se sintetiza por PCR o con un
nucleótido modificado. La sonda de RNA se
sintetiza a partir de una transcripción in vitro,
usando un nucleótido modificado.

UNIDAD 2: METODOS PARA LA FORMACION
DE DNA RECOMBINANTE, CLONAMIENTO Y
MUTAGENESIS
Estrategias para identificar y aislar genes
Un clon es un conjunto de entidades biológicas
que son genéticamente idénticas. Se generan por
reproducción asexual o clonación.
exones. Por lo tanto, si se quiere amplificar una
proteína lo mejor sería utilizar mRNA.
Para amplificar por PCR se necesita purificar y
extraer el DNA. Es necesario unos partidores
específicos de un pedazo de la hebra, lo que sirve
para amplificar. Así se multiplicar y se va
conociendo lo que sirve de la secuencia. Este
DNA se pone en un vector de clonamiento para
guardarlo.

Para el clonamiento desde un genoma se aplica

un procedimiento para aislar un gen. Se puede
hacer por bacterias donde hay múltiples copias de
un vector recombinante que porta un inserto de
interés. Para clonar el inserto se inserta en un
vector de forma que se genere un recombinante
entre inserto y vector para que sea clonado en las
bacterias. También se puede hacer una
amplificación por PCR:

También se puede por el RT PCR (RNA

mensajero tiene cola poli a) esta sirve como punto
de origen para la transcriptasa y luego se
amplifica con PCR estándar.

Por un vector (vehículo apropiado) y un DNA

foráneo se genera un vector recombinante. Eso se
inserta en una célula por medio de una enzima
ligasa y una enzima de restricción que abre el
vector. Luego se prolifera, generando múltiples
copias de recombinantes con el DNA foráneo.
Esto se hace ya que el plásmido posee el origen
de replicación. Un DNA solo sin clonar en un
vector se degrada en poco tiempo. En colonias es
posible auto preservar por muchos años. Es
importante poner el inserto en un vector para que
ocurra la replicación.
La diferencia entre un PCR desde mRNA y del
DNA es que el primero no tiene intrones, solo
Construcción y uso de librerías de genes
Una genoteca es un conjunto de genes. Se puede
clonar un gen en específico, aislar un DNA
genómico, donde cada vector en la librería porta
un fragmento de distintos genomas.
Los vectores recombinantes de distintos insertos o
inserto único. Si se tiene todo el genoma se hace
una buena genoteca. De esta forma se incorporan
en distintas células hospedadoras y se siembran y Múltiples placas constituyen el genoma.
proliferan en presencia de antibióticos. Cada
1) Aislar el DNA genómico
colonia porta copias iguales.
2) Se debe fragmentar según tamaño de
También se pueden hacer librerías del cDNA vector. Esto se puede hacer
gracias a la acción de transcriptasa reversa sobre mecánicamente (jeringa o sonicación). El
el DNA mensajero. tamaño de corte depende del tamaño del
genoma. También se puede hacer por
En si las librerías sirven para fragmentar genoma
enzimas de restricción
y luego reconstruir.
3) Incorporación de los fragmentos de DNA
genómico en vector
Vectores para construir genotecas genómicas
  Sirven para identificación de genes de
importancia farmacéutica
 Sirven para la identificación de genes
silentes (no se expresan)
 Comprender complejidad de los genomas
 Para estudiar la función de secuencias
regulatorias, intrones o secuencias entre
genes.
Genotecas de cDNA
Los insertos representan los transcritos, para
obtenerlos se debe extraer el RNA total o subtipos
Con la secuencia generada sí coinciden unos con de RNA. Luego se sintetiza cDNA de doble hebra.
otros, se ensamblan o sobrelapan y se genera
contig mediante ensamblado virtual.
El numero óptimo de recombinantes depende del
tamaño del genoma y de la longitud de los
insertos.
Es mejor que se repitan a omitir. La genoma debe
estar representada 5 o 10 veces por cada
secuencia para aumentar la probabilidad de
encontrar algo.

Insertos
La calidad del cDNA depende de:
1) Integridad de los RNAs aislados (se debe
evitar su degradación)
2) Síntesis completa de cDNA (secuencia
de RNA completa)
Aplicaciones de librería cDNA (solo lo que se 3) Representación de transcritos poco
expresa) abundantes

 Primera etapa de un proyecto de Los vectores para insertos relativamente

secuenciación de DNA pequeños deben ser plásmidos o derivados de la
bacteriófaga lambda.
Para aumentar la representación de transcritos
poco abundantes se hace una genoteca sesgada
o enriquecidas en determinados cDNA
Las genotecas sesgadas o enriquecidas en
denominados cDNAs es una técnica utilizada para
extraer aquellos mRNA que no se encuentran en
el control sin estimulo, es una especie de filtro.
Nos deshacemos de los híbridos de control-
mRNA, quedándonos con los solitarios por no
coincidir.
Identificación de un DNA de interés desde una
librería de genes
Para identificar un DNA desde la genoteca se usa
la hibridación. Con un DNA de una hebra se
formará un hibrido (por complementariedad desde
otro origen). Esta sonda o hebra complementarias
esta marcada. Para que ocurra esto último se
cambia el fosforo (isotopo radioactivo de fosforo).
Luego se lava para que todo lo que no se haya
unido no se quede. Las hebras clones se
desnaturan con pH alcalino.
Tipos de sonda
 Homologas: mismo gen, se puede tener
un pedazo del gen. Con esto se puede
identificar el mismo gen o regiones
reguladoras. Luego se puede completar
la secuencia y encontrar el partidor, para
esto, se toma un pedazo del gen y se
reorganiza la librería, de tal manera que
se puede encontrar el pedazo. Cuando
se tiene un cDNA clon, pero se quiere
clonar el gen desde el DNA genómico
(con intrones) esto es homologo al
concepto anterior.
 Heterólogas: es sonda complementaria al
DNA pero es de otro origen biológico
(distinta especie)
 Oligonucleótido: son de solo una hebra y
son sintetizados químicamente. Son mas
cortos
Como el DNA es degenerado (un aminoácido
puede dar a varios codones), si conozco la
secuencia de aminoácidos, es posible una
traducción a DNA, pero como es degenerado, no
se sabe cual secuencia especifica es. Es por eso
por lo que se hace una sonda de todos los
codones posibles y se manda a sintetiza. Así se
sabe si esta el gen o no.
Chromosome Walking
Por clonación se va avanzando en la secuencia de
DNA. Es difícil encontrar un clon para encontrar
pedazos grandes.

Síntesis de ADN por métodos químicos

No se hace en el lab, sino que se manda a
sintetizas. Se llega a una estructura muy parecida
al de una célula DNA y se usa.
Nucleótidos fosforamidita son los que están
protegidos para evitar productos secundarios.
Tiene la capacidad de polimerización. Creando
una cadena con la remoción de grupos
protectores. Los grupos protegidos se
desprotegen para formar una hebra de DNA corta
(oligonucleótido).
En este caso, a diferencia de la síntesis
enzimática,
ocurre de 5’ a 3’. Donde cada nucleótido es
agregado tiene en el extremo 5’ DMT para
Unión entre un DNA foráneo (inserto) y un vector
protegerlo de que reaccione con otro grupo.
También tiene un disopropileno en el extremo 3’. Lo normal sería lo siguiente:
después de la unión, se retira DMT
 Para el caso de los romos, se pueden agregar
nucleótidos con DNA polimerasa I para que
rellene con los faltantes. Si no hay, se eliminan los
restos por DNA polimerasa T4.

Vectores tienen polylinker que tiene muchos sitios

de restricción. Uno de los métodos es la ligación.
Se tienen dos tipos de insertos

Caracterización del DNA clonado

Se debe caracterizar para saber lo que es y si es
el de interés. Para ello se siguen los pasos de:
1) Mapeo de restricción: se debe detectar la
ubicación de los sitios de reconocimiento
para las enzimas de restricción, de forma
que se puede fragmentar el DNA si es
necesario.
2) Hibridación southern: se identifica dónde
está el gen de interés
3) PCR
4) Secuenciación
Genoma: toda la información genética de un
organismo. Es el conjunto de DNA de un
organismo
Para ligar los cohesivos es necesaria una
Genómica. Es el estudio de la estructura, función
modificación de extremos del DNA (inserto o
y herencia del genoma. La genómica estructural
vector). Utilizando las mismas enzimas de
es sobre el mapa del genoma, donde están los
restricción para el vector y el inserto, de manera
genes, mientras que la funcional se estudia que
que se forme una unión covalente y luego son
hacen las secuencias del genoma.
unidos por la ligasa.
Un mapa genético es la representación de genes
en un arreglo lineal. Mientras que el mapeo
genético es la técnica genética para construir
mapas que muestran las posiciones de genes y
otros rasgos de secuencia en un genoma. Alguna
de sus funciones es experimentos con
cruzamientos (estudiando cómo se va heredando
un marcador genético) o un examen de la historia
familiar (pedigri).
Los marcadores genéticos son las características
ubicadas en regiones específicas de un
cromosoma que permiten diferenciar individuos
que puede o no tener una función biológica. Los
marcadores moleculares son DNA o proteína.
• Se emplean en la identificación de rasgos
relacionados con enfermedades o condiciones
anormales heredadas.
• En la identificación de especies, individuos u
organismos.
• Aplicable en estudios de población y estudios de
variaciones genéticas.
• Análisis filogenético
• En programas de mejoramiento y selección de
cultivos

Estos pueden o no ser una función biológica, por • Mapeo de genes

ejemplo, podría ser un intrón. Hay marcadores • Prueba de semillas
morfológicos y moleculares (DNA o proteína).
• Experimentos de clonación y transferencia de
genes (transgénesis)
T-RFLP es terminal restriction fragment length
polymorphism

Un ejemplo de un marcador molecular es el

numero variable de repeticiones en tándem
(VNTR). En este caso, la secuencia no es lo
variable sino las repeticiones.

¿Por qué el rRNA 16S es considerado un

marcador filogenético?

 Participa en traducción de proteínas. Po

Otro ejemplo son SNP (Single nucleotide
polymorphism) que es cuando ocurre un
polimorfismo en un nucleótido y este asociado a
un marcador molecular. También los sitios de
restricción.
Aplicaciones de los marcadores moleculares
lo tanto es universal
 No se transfiere horizontalmente
 Largo conveniente: 1500 bp
 Presenta regiones altamente
conservadas y otras especie-especificas
 Hay grandes bases de datos con
secuencias de rDNA
Otros marcadores filogenéticos son las proteínas
(difícil identificar homologas), 5S rRNA 23S rRNA
y 18S en eucariontes
Técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos
Son antiguos, pero uno se sigue usando en lab.
Sirven para detectar las bases de una molécula de
DNA, esto sirve para conocer primer, para ver las
variaciones, encontrar genes. Tiene una historia
larga comenzando por 1965 agrupadas en 3.
Los alineamientos globales son la comparación
entre la similitud de proteínas mientras que los
locales de fragmentos.
En esto se determina el orden preciso de las
bases nitrogenadas de un fragmento de DNA.
Primera generación

 Método Maxam-Gilbert: sirve para

secuenciar fragmentos cortos (50 a 80
bases) se hacía directamente, sin
partidores (por lo que también se llama
secuenciación química). Se extraía el
DNA y lo separaban como hebra simple.
Luego, usando T4, se marcaba el
extremo 5’ OH con 32P radioactivo. Paso  Método de Sanger: Plus y minus. Este
siguiente es romper la cadena por medio detecta 32P fosfato generando copias del
de productos químicos tóxicos que DNA que se está sintetizando. Se
reconocen nucleótidos específicos separan en grupos y se separan en A+ y
simples o de pares C- de tal manera que se predice para
verificar la secuencia.

Esto generaba trozos de distinto tamaño

y se conoce por medio de un gel de
acrilamida. Así, leyendo de abajo hacia
arriba se tenía la secuencia de DNA
completa.
En el caso de menos, polimerasa y una
mezcla de nucleótidos (menos 1) se añaden a
cada una de las cuatro alícuotas: ACG (-T),
ACT (-G), CGT (-A), AGT (-C). Como
resultado, en cada caso, la cadena de ADN
se extiende hasta un nucleótido faltante.
En el caso de más, solo se agrega un
nucleótido a cada una de las cuatro alícuotas
(+A, +C, +G y +T) y se usa la ADN
polimerasa T4. La ADN polimerasa T4 actúa
como una exonucleasa que degradaría el
ADN desde el extremo 3' hasta un nucleótido
que se suministra en la reacción.
Para este caso, primero se desnatura el DNA
con calor y se amplifica la secuencia
utilizando un primer. Esto se deposita en 4
partes iguales con DNA polimerasa, los 4
nucleotidos y ddNTPs agregados (cado uno
distinto). De esta manera, el nucletotido dd es
apareado se corta la cadena porque carece
de grupo hidrogeno en el extremo 3’. Así, se
cortarán fragmentos de distinto largo lo que
se verá mediante electroforesis. Esto se lee
de abajo hacia arriba
 Método de Sanger Chain termination. En
vez de ser un dióxido de nucleótido, es
un dideoxinucleotico el cual no produce
ataque cortando la cadena. Con 4
reacciones de nucleico se agrega
diodeoxido, de tal manera que se detiene
antes. En cada uno se pone distintos, de
tal manera que se determina cuando
termina. Luego en un gel se corren los
productos según el tipo de nucleótido. Se
pueden leer entre 150 a 300 nucleótidos.
Esto después se pudo automatizar
mediante una proteína fluorescente del
dideoxidonucleico, detectando cuando
estaba el nucleótido por electroforesis
capilar
Segunda generación
El shotgun era muy engorroso, por lo que se
actualizaron los modelos. Los adaptadores son
fragmentos del DNA generando un código de
barras. Esto permitió que se amplificara el
fragmento especifico (artificial agregado) a través
de PCR en sustratos aislados e inmovilizados.
 El PCR en emulsión de librerías
“barcodeadas” es un sistema que a partir
de una emulsión está el fragmento
acompañado de un bead. Al
desnaturarlo, la hebra se va a separar
produciendo un hibrido con el bead
reconociendo el adaptados.
Estas bolitas se ponen en una
microcápsula y se espera tener un
fragmento de DNA distinto en cada uno.
La gracia está en el piro secuenciación
que emite una luz en cada pocillo según
el nucleótido. Se van añadiendo poco a
poco asociado la amplitud como la
cantidad identificada.
Consiste en una mezcla de aceite y agua para
encapsular complejos entre el DNA y nanoesferas
dentro de las gotas de agua, así queda recubierta
por varios miles de copias de la misma secuencia.
Estas se unen a la superficie de cristal.
 Amplificación en puentes (brigde PCR).
Aleatoriamente se une un adaptador con
fragmentos de DNA. Se pega a una
superficie y se agregan nucleótidos y se
amplifica como puente hasta doble
hebra. Al desnaturar, se queda la hebra
simple.
En una placa de vidrio con adaptadores
complementarios a los adaptadores anclados en
las secuencias desnaturalizadas a secuenciar de
forma que DNA se unirá por uno de sus extremos
a uno de los oligonucleótidos complementarios en
la placa. Luego, las polimerasas sintetizan la
cadena complementaria y se desnaturara
formando puentes. Esto se repite varias veces
hasta formar los clusters (agrupación de
secuencias idénticas inmovilizadas por una
superficie solida). Cada nucleótido expresa una
señal de luz distinta
cll
Tercera generación
  Single molecule sequencing PacBio
ZMW nanostructures. Este genera una
descomposición natural de la luz en un
espacio nano. Con una polimerasa fija
emite una onda cada vez que se une el
nucleótido. Se llama molécula única por
ser un DNA sin amplificación.

Secuenciación en tiempo real de DNA de una

hebra. Por medio de una lectura se leen varios
nucleótidos. Así hay una cobertura uniforme. Se le
ligaran adaptadores a ambas cadenas, generando
un DNA circular de una hebra y se le agrega una
polimerasa. A medida que se van agregando los
nucleótidos, se identificará con una luz en tiempo
real.
 Oxford Nanopore minION. Es parecido
por tener polimerasa inmovilizada y se va
desenrollando, alterando un potencial
electroforético, haciendo un cambio de
potencial en una membrana. No se
agregan nucleótidos, solo se tiene que
encontrar la hebra con el poro.
Aplicaciones NGS
 estudiar la biología evolutiva y filogenia, genómica
comparada, análisis de secuencias

Para estudiar el alineamiento y comparación se

estudia que secuencia es (DNA o RNA) a que
organismo pertenece, posee dominio funcional
(factor transcripción, DNA polimerasa), si existen
secuencias así en otro organismo. El alineamiento
es por medio de un algoritmo que compara dos
secuencias con nucleótidos iguales. Estos pueden
ser categorizados como:

 Pares (dos secuencias)

 Múltiples (más de dos secuencias)
 Globales (toda la secuencia)
 Locales (de una región de la secuencia)

Conceptos clave:

 Identidad: porcentaje de coincidencia

entre las secuencias analizadas
 Similitud: porcentaje de residuos
Métodos bioinformáticos de alineamiento y alineados entre las secuencias, que
comparación de secuencias tienen características fisicoquímicas
similares y puedes ser sustituidos entre si
La bioinformática es el campo que desarrolla
 Cobertura: cuantos pares calzan en total.
procedimientos computacionales para analizar
Depende de si es global o local, vale más
grandes colecciones de datos biológicos, como
cuando es global
secuencias de código genético. Puede ser para
La similitud en la alineación indica el
parecido entre dos secuencias cuando se
comparan, mientras que la identidad en la
alineación de secuencias indica la cantidad
de caracteres que coinciden exactamente
entre dos secuencias diferentes.
Gap es un nucleótido que se inserta de tal forma
que calzan las secuencias
Algoritmo de Needleman-Wunsch
Se desea alinear globalmente dos secuencias.
Este algoritmo tiene la gracia de que le asigna al
alineamiento un puntaje (score scheme). El
puntaje de alineamiento es por la suma de los
más altos. Para configurar el esquema de puntaje
se usa matriz de sustitución. Lo mismo con
aminoácidos. El primer problema se soluciona con
un valor llamado puntaje de alineamiento. El
segundo problema se soluciona por un algoritmo
de iteración por programación recursiva. Este
reduce el número del largo a través de comparar
dominios pequeños de la secuencia en 3 pasos:
1. Iniciar la matriz de puntaje con
penalización por gap (-1)
2. Se rellena la matriz de puntaje a través
de la siguiente formula
3. Rellenar de traceback y elegir el camino
que maximice el puntaje
Comenzando con un 0 en la esquina superior
izquierda, se comienza poniendo -1 disminuyendo
a la derecha. Luego en cada cuadrante se inserta
el numero mas alto de las 3 opciones. Siendo
S(i,j) puntaje de que calcen, g el puntaje de gap y
los primeros términos es el que corresponde al
valor de diag, up o left.
Después de rellenar todo, se hace el recorrido de
los mayores puntajes obtenidos comenzando
desde la esquina inferior derecha.
Algoritmo de Smith-waterman
Modificación de NW que logra encontrar solución
para el mejor alineamiento local.
Se comienza en el mayor valor de la matriz y
continua hasta encontrar un valor cero que sera el
mejor local.
Es para secuenciacion local, descomponiendo en
varios problemas mas pequeños. Se comienza
poniendo un 0 en la esquina superior izquierda y
se pone la penalizacion en de gap corriendo a la
derecha y para abajo (sumandose al anterior igual
que needleman). Para este algoritmo, todos los
valores negativos se ponen como 0. Luego se ve
diagonal, izquierda y arriba y se suma en cada
alternativa el gap o match, quedandonos con el de
mayor valor.
Luego se eligen los valores mayores recorriendo
de derecha inferior hasta que se encuentra un 0 y
se detiene, encontrando el mejor valor local.
Blast: basic local alignment search tool
Es heuritica, es decir, se encuentra una solucion
pero no necesariamente la mejor. Funciona con 3
etapas: preprocesamiento y simbra, extension y
evaluacion. Se usan tres parametros: T (umbral),
A (distancia) y W (tamaño de palabra).
Este metodo sirve para buscar bases de datos de
proteinas como de nucleótidos. Hay de varios
tipos según las necesidades:

 Blastn: búsqueda de nucleótido a

nucleótido (n vs n)
 Blastp: búsqueda de proteína a proteína
(p vs p)
 BlastX: toma una secuencia de
nucleótidos, la traduce la secuencia en
sus 6 posibles marcos de lectura (3 x
hebra) y compara estas secuencias
traducidas contra una base de datos de
proteínas (n -> p vs p) 2) Extension
 TBlastn: la secuencia query es una
proteína y se compara contra las
secuencias nucleotídicas de la base de
datos transformadas, en sus 6 posibles
marcos de lectura, en proteínas (p vs n ->
p)
 TBlastX: la secuencia query es de
nucleótidos, traducidos en sus 6 marcos
a proteínas, y se compara con la base de
datos de nucleótidos, traducidas en sus 6
marcos de lectura(n->p vs n->p)
 Bl2seq: alinea dos secuencias
3) Evaluación

1) Preproceso y siembra

La secuencia query se divide en fragmentos mas
pequeños tal que se pueda leer (por ejemplo de
3). A traves de esta se buscaran todas las
secuencias que contienen esas letras y se le
asignara un puntaje establecido. Luego se
extiende este alineamiento inicial en ambas
direcciones.
El algoritmo termina cuando el valor total de
puntaje disminuye por encima de un valor X o se
hace 0.
Clustal: alineamientos multiples
Hablamos de alineamiento multiples cuando se
están analizando mas de dos secuencias. Es
complejo ya que todas las secuencias deben
terminar con la misma longitud por medio de gaps
de alineamiento. Para realizarlo se van
comparando de dos en dos, construyendo una
matriz de distnacias creando un arbol guia y así
encontrar las secuencias mas similares.
Anotación de secuencias
Es un conjunto de protocolos que asocian la
secuencia de DNA atributos para interpretar la
informacion de una cadena según:
 estructura del genoma: ubicación de
genes y otros elementos como
secuencias repetidas, rnas no
codificantes, sitios repetidos, etc.
(Anotación estructural)
 funcionalidad de los genes: poder asociar
a la secuencia, mediante comparación
con bases de datos, un potencial rolo
biológico. (Anotación funcional)
Es un proceso de varias etapas para armar el
genoma completo
Hay 3 tecnicas para identificar genes:
AB initio: es desde el inicio según estadisticas, sin
comparar con otras secuencias. Se basa en la
existencia de señales en los genes; codones de
inicio, termino, splicing sitionde union de proteinas
ribosomales. Además el contenido per se de la
secuencia, las regiones codificantes no varian de
la misma forma que las no codificantes.
Cuando son procariontes, se basa en ORF mas
largo. Asi se hace un algoritmo basado en el uso
de codones. Como el DNA es degenerado, se
debe calcular el encuentro de cada codon. Como
todos los codones tienen frecuencias similares de
aparicion, hay una probabilidad de 1/64 de
encontrar un codon de inicio y 3/64 de uno de
término.
Para el caso de eucariontes, se tienen exones,
intrones y splicing, por lo que es mas dificil. La
interaccion entre exones e intrones siguen la regla
GT-AG. Además , como existe una alta densidad
de CG cerca de un gen.
Metodos por homologia: por medio de software se
comparan las secuencias de proteinas conocidas
y almacenadas en bases de datos. Los programas
se basan en el orden de los exones y secuencias.
Normalmente se complementan con otro metodos
porque suelen ser ineficientes. La limitante es la
disponibilidad de secuencias templado en las
bases de datos contra las cuales buscar.
Metodos comparativos: DNA se compara con otro
DNA similar de una especie diferente (con tener
cuidado de la distancia evolutiva) de forma que se
predicen los genes en ambas secuencias
basandose en la suposicion de que los exones
estarran bien conservados y los intrones no.
La anotación funcional consiste en asisgnar las
funciones biologicas a los genes encontrados.
El analisis GO: the gene ontology consiste en
asignar por medio de un vocabulario, las
funciones que describen a un gen y sus productos
genicos. Se dividen en dos partes:
 ontologia per si: funcion molecular,
proceso biologico y localizacion celular.
 Anotacion: caractizacion de un
gen/proteina utilizando dicho vocabulario
Si un organismo no tiene base de datos GO, se
realiza una anotacion transitiva. Se actualiza
constantemente, pero el `problema es que hay
una identificacion masiva de proteinas pero que
aun no se les encuentra su funcion.
Microarreglos
La expresion genica no es lineal, es decir, cuando
actua la polimerasa no se genera solo un
transcrito, ya que ésta puede pasar muchas veces
por la misma secuencia generando muchos
transcritos.
Para medir la expresion genica:
Existe un cambio de paradigma que antes se
decía que con pocos genes se tenían pocas
funciones, luego que muchos genes, igualmente
se encontrarían pocas funciones. Así se
necesitaba otra técnica (no northern blot) para
poder hacer una interferencia sobre sus funciones,
ya que este se hacía un gen a la vez.
En la era ómica, se hace el estudio de todos los
genes expresados por una célula o un conjunto de
ellas en respuesta a agentes externos
(ambientales) o internos (programas genéticos
establecidos).
• Entender la función de los genes en términos de
dónde y cuándo se expresan.
• Entender bajo que circunstancias los niveles de
expresión de un conjunto de genes se ven
afectados.
• Determinar patrones de expresión comunes de
grupos de genes (vías metabólicas o procesos
biológicos).
Los microarreglos es la técnica más famosa y útil
para poder estudiar un grupo de genes. Esta es
una disposición ordenada de muestras (sondas)
en un sustrato fijo que son utilizadas para la
identificación de elementos complementarios en 1. Un sustrato (arreglo) que contiene sondas
una muestra compleja (blanco). Existen diversos específicas para los genes del organismo en
tipos y se clasifican según su sonda: estudio. Estos pueden ser confeccionados o
adquiridos.
 De expresión:cDNA, oligonucleótidos
 DNA genomico: SNPs (single nucleotide 2. RNA total o mensajero extraído en al menos
polimorfism) dos condiciones, una de ellas la referencia
 DNA genomico: CGH (comparative 3. cDNA retrotranscrito desde el RNA extraído y
genomic hibridization) modificado químicamente por la adición de
 Tejidos nucleótidos fluorescentes.
 Proteínas
 Anticuerpos 4. Una etapa de hibridación donde se ponen en
 Carbohidratos contacto las muestras marcadas en el arreglo.
 microRNAs 1. Fabricación del sustrato: spotting
 metilacion
• Son confeccionados por “spotting” de productos
Por medio de una superficie con divisiones y de PCR (0.5 – 2.5 kb) u oligonucleótidos (20-60
sondas, se inserta una muestra y habrá pb)
hibridación emitiendo fluorescencia. Son útiles
para análisis genómicos, transcriptómica y • Pins colectan entre 250-500 nl y depositan entre
proteómica (DNA, cDNA y proteínas 0.25 y 1 nl por spot, cuyo diámetro es entre 100-
respectivamente). Antes se podía estudiar un gen 150um
a la vez, con este método se puede analizar
varios a la vez. Usos:
 cuantificar un conjunto de mRNAs o
miRNAs de una muestra (expresión)
 inmunoprecipitación de cromatina,
identificando sitios de unión de proteínas
a DNA
 Análisis de SNPs (marcadores genéticos
a gran escala)
 Hibridación genómica comparada,
localización de reordenaciones
cromosómicas
 Secuenciación e identificación de
secuencia nucleotídica
1.Fabrica del sustrato: fotolitografía
La hibridación genera una luz que se puede
medir. De manera que, si se detecta color verde, • Múltiples oligonucleótidos de diferente secuencia
se identifica la secuencia control, rojo si es la diseñados para hibridarse a diferentes regiones de
muestra y amarillo si se realizó la hibridación. este RNA

Microarreglos de expresión • Sondas de control (MM) que son idénticas a sus

La hibridación en microarreglos está basada en 4
pilares
compañeras de concordancia perfecta (PM),
excepto por una sola base. Las sondas MM
actúan como controles de especificidad que
permiten sustraer directamente el fondo y la
hibridación cruzada
Una máscara protectora es un nanopolimero
sensible a la luz. Una vez que se elimina vuelven
a reasociarse nucleótidos unidos a una protección
que hace de análogo de nucleótido, para luego
volver a colocar la máscara. Se repite el proceso
hasta que se coloquen todos los nucleótidos.

En la hibridación competitiva ponemos dos

muestras de ARN blanco y el cambiado (con una
condición adicional, ya sea peróxido de hidrogeno,
etc) y la idea es poder analizar que sucede con la
competencia entre ambos para hibridar con los
genes que están en el vidrio.
Desventaja: cerrado --> si quiero analizar un gen
que no esté sembrado en el arreglo, no puedo
analizarlo.
Producción de proteínas recombinantes I
Los hongos sirven para expeler las proteínas al
medio extracelular, es decir, para cuando quiera
obtener del sobrenadante la proteína es muy útil.
Generación de la construcción genética en el
vector
Promotor: sitio de unión a la polimerasa
ATG: codón de inicio
RBS: ribosoma binging site, permite que el
ribosoma pueda unirse a la secuencia y comenzar
a traducir la región codificante del gen.
Lo que vale la pena hacer es usar un vector que
ya tenga todas las señales de traducción
optimizadas, es decir, que sean nativas de mi
célula hospedera, pues así me aseguro de que el
gen sea traducido, pues si dejo el promotor y el
resto de las señales que son nativas de mi gen, es
posible que sean incompatibles con el sistema de
mi célula huésped.
Tag: pequeñas secuencias de polipéptidos con los
que se marcan las proteínas para ser utilizadas
con antibióticos, por ejemplo.
Si la estabilidad del mRNA es baja, se producirán
menos proteínas recombinantes puesto a que se
podría degradar antes de ser una proteína. El
promotor ideal se caracteriza por:
1. Promotor relativamente fuerte
2. Promotor regulado, para minimizar la
expresión basal
3. Fácil de inducir (costo efectivo barato)
Mientras más parecida sea la caja al consenso es
mejor el promotor
Si se estresa mucho la célula podría dejar de
reproducirse y la producción de proteínas podría
llegar a un ritmo demasiado lento, eventualmente
sin ser expresada.
Para controlar la cantidad de células sin vector
recombinante, se utiliza un marcador de gen con
resistencia a un antibiótico.
Debido a la alta sobrecarga metabólica, si no
utilizamos antibióticos, el crecimiento de células
sin plásmido se verá muy favorecido puesto a que
poseen menos sobrecarga metabólica, por lo que
es muy importante darles a las células con
plasmidios la ventaja de ser resistentes a un
antibiótico.
Los antibióticos no se mantienen activos por
siempre, a lo más unas 4 o 5 horas, pues las
células comienzan a producir enzimas para
hacerlos desaparecer, proporcionando un gran
problema. Esto es porque cada vez que
desaparece el antibiótico, las células sin plamidio
comenzarán a multiplicarse mucho más.
Para controlar la transcripción se ocupará un
operador al lado de un promotor.
A pesar de que se agregue más OPTG, no será
inducida la producción de proteínas
recombinantes si no hay represor de lactosa
suficiente.
Es importante mantener una expresión basal baja,
pues así mantengo la sobrecarga metabólica
controlada. Para esto el sistema pET se regula
poniendo un operador Iac en el vector pET
además del que se tenía en el cromosoma
bacteriano.
Constitutiva: no regulada
A pesar de que no haya inducción, igual hay
expresión basal de proteína recombinante, pues
los promotores no son tan fuertes para idealmente
reprimirse, entonces entre el lapso que se reprime
y se activa se produce la expresión basa.
La producción de proteínas recombinante es una
alta tecnología que sirvió para proveer
proteína de uso terapéutico con un
abasto asegurado. Un ejemplo es la
inblassulina. Muchas de estas requieren
modificaciones post-traduccionales, a
pesar de que son más útiles las células
eucariontes, la E.coli se ha vuelto una de
las más típicas para este aspecto ya que
su genoma y metabolismo son conocidos
de hace tiempo, además de vectores
Proteínas recombinantes II
Las desventajas de E.coli como hospedero para la
producción de proteínas recombinante son:
 Perdida de plasmidio y la resistencia de
antibiótico. Las células pueden perder el
plasmidio por inestabilidad estructural y
el plasmidio va perdiendo fragmentos,
sobre todo si transportan genes tóxicos.
El cultivo se va nutriendo de estos y
rompen el plasmidio. También está la
inestabilidad segregacional, la cual se
pierde el plasmidio a medida que la
célula se va dividiendo. Esto pasa
cuando se produce sobrecarga
metabólica y se seleccionan aquellas
células que tienen menos plasmidio
 Plegamiento incorrecto de las proteínas,
cuando la estructura no se pliega
correctamente, acumulando la proteína
recombinante como cuerpos de inclusión
(conocidos como agregados insolubles).
 Tiene falta de modificaciones
postraduccionales, hay otras células
eucariontes que necesitan otras
modificaciones que para e.coli no son
posibles.
 Tienen un potencial estrés metabólico
(clase pasada)
 Contaminación con endotoxinas
 Mala secreción de las proteínas
recombinantes
Se pueden enfocar en dos partes de la expresión
de genes para modificar
1) Optimización de señales
transcripcionales, por ejemplo, que un
promotor tenga más fuerza
2) Señales tradicionales. Hay varios
aspectos; estructura del mRNA en el
extremo 5’, sitio de unión al ribosoma
(RBS), disponibilidad de tRNAs para
traducción y estabilidad del mRNA.
Factores que afectan la producción de una
proteína recombinante a nivel traduccional.
Estructura de la secuencia shine-dargarno. Esta
es una secuencia conservada que forma parte del
sitio de unión al ribosoma. En este el ribosoma se
une al mensajero y empieza a avanzar hacia el
codón de inicio para traducir los tripletes de la
proteína
Hay variabilidad en esta secuencia, habiendo una
ideal (mejor para el reconocimiento del ribosoma),
por lo tanto, si se parecen pueden ser modificados
para que se parezca más a la de consenso. De
esta manera se genera una traducción mucho
más fuerte.
El otro problema que puede haber en la traducción
de un gen es el uso de codones en E.coli y
humanos. Como el código genético es
degenerado, este cambia en comparación a las
especies. Por lo tanto, cuando se necesita
incorporar un aminoácido será distinto según las
preferencias de la especie. La preferencia
obedece a la abundancia de los tRNA respectivos.
La velocidad de la producción de la proteína
recombinante dependerá de esto. Así lo ideal es:
1) Usar un hospedero diferente que tiene un
uso de codones similar a los de la
especie, teniendo el mismo uso de
codones del gen heterólogo.
2) Sobreexpresión de tRNAs de baja
abundancia. De esta manera se puede
disponer de ellos.
3) Optimización de codones y síntesis de
genes para acercarse al uso de codones
del organismo hospedero.
Formación de cuerpos de inclusión
Un cuerpo de inclusión es un agregado de
proteínas insolubles (manchas) están pegadas
unas con otras y están inactivas en este estado.
Cuando se está trabajando, se tienen en el pelet
las estructuras insolubles (lo cual es el DNA y las
proteínas insolubles). Como son grandes,
sedimentaran en la centrifugación. En una
electroforesis de proteínas, se encuentra
altamente en una fracción insoluble.
Los cuerpos de inclusión se tienen por varios
factores:
 Producción acelerada de la proteína
sobrenadante. Como se produce muy
rápido (adquiriendo 3D también
altamente) esto provoca que se forme ya
que las proteínas no se pliegan
correctamente y se agregan como
cuerpos de inclusión
 La alta concentración de proteínas puede
cooperar a su formación
 Ambiente reductor en E.coli. esto se
debe a las proteínas tioredoxina y
tioredoxina reductasa que tienen puentes
de sulfuro (importante para la estructura
de la proteína 3D). Una proteína que
tiene esto, se pueden formar los puentes,
pero normalmente estas son tomadas
como sustrato por enzimas reductasa
(reducen los puentes de sulfuro).
Generalmente la Trx su estado redox es
controlado por TrxR, reduciendo esta por
electrones, transformándola con cisteínas
SH. Por lo tanto, la recuperación se
necesita los puentes de sulfuro.
  Falta de modificaciones
postraduccionales, así las proteínas no
se pliegan adecuadamente, facilitando la
formación de cuerpos de inclusión
Recordando plegamiento de proteínas en E.coli
Una proteína sale del ribosoma. Algunas proteínas
necesitan chaperonas y foldasas. Las primeras
son proteínas que no definen el proceso de
plegamiento, pero si ayudan a que la proteína se
mantenga en una conformación adecuada.
Después de esto, se producen en forma nativa.
Una de las soluciones es exportar la proteína al
espacio periplasmatico (ya que aquí el ambiente
no es tan reductor como en el citoplasmático).
Después recuperar las proteínas. También se
pueden sobrexpresar las foldasas
intracelularmente para que estando en el
citoplasma ayuden al plegamiento correcto de las
proteínas
Estrategias utilizadas para reducir la formación de
cuerpos de inclusión
 Co-expresion de chaperonas moleculares
introduciendo vectores de genes extra de
chaperonas
 Uso de cepas huésped deficientes en
tioredoxina y/o tioredoxina reductasa
para mantener un potencial redox
favorable.
 Crecimiento de los cultivos bacterianos a
bajas temperaturas (20-25ºC). de esta
manera la velocidad de la producción va
a disminuir.
 Fusión a polipéptidos altamente solubles
como por ejemplo maltose binding
protein. De esta manera, será favorecida
el plegamiento correcto
 Agregar a la proteína recombinante una
señal de exportación para secretarla al
medio o al periplasma. El péptido señal
añadido es en simultaneo al gen y es
esencial para dirigir las proteínas a la
membrana y translocarlas.
Aunque estas estrategias han aumentado la
producción de varias proteínas recombinantes, su
éxito parece ser especifico de cada proteína.
Al enviar proteínas al medio extracelular pueden ir
al periplasma o al medio de cultivo. No es
especifico (señal particular), en E.coli la
exportación es al periplasma pero que luego son
liberadas al medio extracelular de forma
inespecífica. Esto tiene ventajas y desventajas.
Ventajas:
 Purificación más simple porque hay
menos proteína en el periplasma. Al
querer purificar, esta menos
contaminada.
 La acumulación de la proteína
extracelular puede favorecer un
plegamiento correcto en el espacio
extracelular
 Hay mayor estabilidad
de las proteínas
recombinantes ya que
no se degradarán por
proteasas
Desventajas
 Proteínas más diluidas en el
sobrenadante que adentro de las células.
Así para seguir procesando para
purificarla es complejo cuando se está
trabajando en grandes volúmenes.
Estrategias de modificación del genoma IN VIVO
la modificación del genoma en organismos tiene
como objetivo la inactivación de genes (gene
knockout), reemplazo de genes (gene targeting),
incorporación de genes foráneos (transgenesis),
introducción de mutaciones puntuales.
La recombinación homologa es un intercambio de
frecuencias de DNA y es usada para
modificaciones.
Poniendo en contacto dos DNA linealizados, las
zonas homologas se catalizan el intercambio. De
esta forma se incorpora la región eliminando la
nativa.
EL marcador de selección (verde en imagen) es lo
que se introduce como marcador (por ejemplo un
gen de resistencia a antibiótico). De esta forma,
en el cultivo solo quedaran aquellas que tienen
este gen y con ello la modificación.
Se puede diseñar un vector de tal manera que las
secuencia homologa contenga el gen (izquierda).
En cambio, en la derecha se observa que solo hay
una zona, metiéndose todo al genoma sin
intercambio. Estos dependen de la forma en que
se construye el vector.
Un gen puede ser eliminado por KO o se puede
realizar gene targeting. Otra aplicación es reparar
un gen. Por ejemplo, por una mutación si se
transforman las células. En esto se reemplaza el
gen mutado por uno sano.
También esta el caso de eliminar un exón. Esto se
utiliza para entender la funcionalidad de esa parte
en el organismo o célula.
Como se opera
Se puede hacer después de la fecundación
introduciendo DNA (transveccion) con el vector
exógeno. Luego se selecciona para que solo
queden las de la recombinación.
Con recombinación homologa, puede que se
integre en el sitio, pero también puede estar en
otro lado, causando una recombinación homologa.
Así, se usan estrategias adicionales con el gen de
la timiniquinasa se producirá un efecto toxico si no
es por homologo (negativa). La droga se
encuentra fuera por lo que no se va a insertar si
son homólogos.
Para la estrategia positiva
Para identificar la región homologa se puede usar
southern blot, por medio de hibridación fuera de la
zona de recombinación homologa. Así, como
sabemos los alrededores de la inserción se puede
verificar.
También se puede hacer por PCR desde fuera del
fragmento del gen.
Por medio de la ablación de genes (OK) se puede
ver que consecuencias tiene el no tener la
proteína.
Se puede usar gene targeting para inactivar genes
por knowckout génico. Así saber que puede
mejorar para repara una modificación o que
terapia usar.
Sistema Cre loxP
Es un sistema knock out restringido, es decir no
en todo el organismo. Se usa un sistema de
recombinación sitio especifico, ocurre en
fragmentos no homólogos.
La recombinasa actúa aliminando todo lo que esta
entre medio. Por lo tanto, con el cruce se provoca
la modificación.
Crispr- cas 9
Edita el genoma. Por medio de un RNA guía tiene
secuencias completarías la sitio de unión.
1) Se corta el DNA por nucleasas Cas9
2) Reparación con DNA exógeno
Esto se descubrió en bacterias. si estas
detectaban una presencia de virus, tendrían
mecanismos de defensa, uno de ellos es integrar
el DNA a su genoma, para luego transcribirlo y
cortarlo, uniéndolo a la proteína cas, formando un
complejo que va a degradar el DNA de otra
infección.
Para el caso del sintético (a voluntad hasta células
eucariontes) se usa un RNA guía que se une a la
Cas9. Con secuencias complementarias en la
región deseada.
Los desafíos del CRISPR son:

 Mutaciones of target se deben al ARN

guía (por ser muy corto) ya que es poco
especifico, produciendo ediciones en otro
sitio. Esto se puede reparar haciendo
modificaciones para mas especificidad.
 Cas9 puede cortar sin ARN guía, se
soluciona con enzimas más precisas.
UNIDAD 6: BIOTECNOLOGIA VEGETAL
1. Cultivo de tejidos vegetales y técnicas
para la transformación de plantas
Las células vegetales son totipotentes (se pueden
regenerar un organismo completo). En la imagen
b se esta haciendo una propagación vegetativa
con el mismo genoma (si es que no hay una
mutación) que su origen. Es una reproducción no
sexual vivipery.
En 1950 se hace la primera clonación de una
planta entera desde el cultivo in vitro. Por una
solución y agitador se mantienen las células en
suspensión para después reproducir una planta
completa. El embrión define la organización del
organismo.

 Agrobacterium

Las fitohormonas son hormonas vegetales

reguladoras de crecimiento. Por un pedazo de
tejido se pone 2 tipos de esta hormona y se
aumenta su concentración.

Aplicaciones del cultivo in vivo

 Cultivos libres de virus

 Semillas artificiales (sinteticas)
 Rescate de embruones
 Cultivo de especies recalcificantes y en
peligro de extinción
 Cultivo in vivo para modificación génica
de plantas
 Generación de híbridos por fusión de
protoplastos
 Poliplodia
Técnicas para transformación de plantas
Por medio de una bacteria que en su plasmidio (T-
plasmid) tiene una secuencia bordeada y tiene el
T-DNA. Este se transfiere al genoma vegetal.
Forma tumores porque hay genes que cambiaran
aumentando el crecimiento.
 Gene gun
 2. Clonación y vectores para la
transformación de plantas
 Electroporation de protoplastos

Se posiciona un marcador y un gen de interés

entremedio lo que se integra. Se debe verificar
que se realiza una vez no más.

 Microinyección
3. Estrategias biotecnológicas para el
mejoramiento de plantas
La riqueza del germoplasma es muy
importante a nivel mundial. Hay uno en
Norway que abrió el 2008

Liebig’s Law (ley del mínimo) postula que va a

funcionar bien según el mínimo recurso que
haya, como reactivo limitante.
WUE es la eficiencia de uso de agua y NUE
es la eficiencia de uso de nitrógeno.
El desarrollo de nuevas variedades
(diferentes líneas de la planta genotípica o
fenotípica) de cultivares. Se llega cuando la
diversidad por líneas autóctonas o landraces.
Cada nicho esta muy aislado del otro según
su entorno, pero después se van juntando,
adaptándose haciendo nuevas especies.
Se usan marcadores moleculares como SSR
(repetición DNA Pol II tiene un retraso
causando problemas o errores para provocar
diresidad) y SNP es el cambio de un
nucleótido.
Marker assited selection (MAS) es un
invernadero que prueba los cambios
climáticos

Por reactor nuclear, una vez al mes el reactor Gene pyramiding se hace cruces múltiples
hace una radiación gamma haciendo entre varias plantas para lograr los rasgos
mutaciones aleatorias. deseados.

Realizando cuces por fenotipos deseados. se

puede hacer en laboratorio, bacterias brigh
4. Manipulación biotecnológica de rasgos
(exterior) y ohosphoro deficiency (exterior con
importantes en plantas
poco fosforo)

5. Barreras ambientales y sociales de las

tecnologías de generación de plantas
modificadas genéticamente
Vacunas
Conceptos esenciales
Una vacuna induce la respuesta inmune a un
patógeno especifico y protege de la enfermedad al
receptor de la vacuna. La inmunidad se debe a la
generación de anticuerpos contra antígenos del
microorganismo patógeno. Una buena vacuna:

 Protege de la enfermedad
 Segura ante otros efectos secundarios
 Fácil administración
 Bajo costo De esta forma, se combate con antígenos que
entran por segunda vez al organismo. Lo
Las células presentadoras de antígeno (APC) son fundamental es la activación de células B de
aquellas del sistema inmune que ingieren, memoria, las cuales inducen los anticuerpos.
procesan y presentan los antígenos procesados. A
través de una reacción por un receptor y
antígenos (receptor ligando) haciendo que la
receptora de antígeno madure a T helper o T
cytotoxic, induciendo una respuesta inmune
posterior. Una vez el antígeno de la presentadora
entra, se degrada a pequeños péptidos,
conducidas a la superficie para ser expuestas a
través de sistema MHC (mayor de
histocompatibilidad). De esta manera, otras
células del sistema inmune reciben los péptidos
expuestos y desencadenan la maduración. Esto
es lo que primero pasa cuando un antígeno entra Este grafico muestra como reacciona el cuerpo al
a un organismo. exponerse a dos antígenos distintos. Hay tipos de
inmunizaciones:
1) inmunización pasiva: ocurre por
transferencia de anticuerpos preformados
a un individuo no inmunizado. Así, el
individuo desarrolla inmunidad temporal a
un organismo o toxina particular por la
presencia de estos anticuerpos
preformados. Cuando se destruyen el
individuo deja de ser inmune. Esto puede
ser natural o artificial; natural cuando hay
un paso de anticuerpos maternos de la
placenta al feto (o también cuando la
madre le da anticuerpos por lactancia),
mientras que la pasiva artificial es
cuando se administra inmunoglobulinas
humanas.
 2) Inmunización activa: cuando se tiene una
exposición de un individuo no inmunizado
a un agente patógeno, desarrollando
inmunidad frente a este agente. Esta
normalmente se produce inmunidad a
largo plazo. Ejemplo de esto son las
vacunas (artificial) y la exposición de un
antígeno (natural).
La composición de una vacuna es:
 adyuvantes (sistemas de entrega o
vehículo que se prepara la vacuna)
 inmunoestimulantes (moléculas que
ayudan a estimular al sistema inmune)
 antígeno es el objetivo inmunológico que
es ayudado por los dos anteriores.
Vacunas tradicionales
La idea de Paster fue que inyectando los
patógenos a personas sanas causaba inmunidad.
Así se crearon los microorganismos vivos
atenuados (siguen vivos pero no producen
enfermedad) y los microorganismos muertos (de
forma que igualmente desafían al sistema
inmune).
 Los sistemas por atenuación de la
virulencia de un patógeno se crean por
medio de la extracción de antígeno y por
medio de pasajes en serie disminuye su
virulencia aumentando su atenuación.
En la siguiente tabla se comparan ambas
estrategias
Los inconvenientes del enfoque de vacunas
tradicionales son los siguientes:
 No todos los microorganismos se pueden
cultivar
 Costo de cultivo de células animales
(para vacunas contra virus por ejemplo)
 Medidas de seguridad para el manejo de
patógenos para el laboratorio. Estos
tienen niveles de seguridad muy altos
para no causar infección
 Rendimiento y velocidad de producción
son bajos
 La inactivación o atenuación no siempre
es total y a veces la cepa atenuada
puede recuperar la virulencia.
Vacunas recombinantes
Dado esto vienen los enfoques modernos para
producir vacunas. Muchos de ellos son
recombinantes que muchas veces no son el
microorganismo patógeno.
 Peptídicas
Son péptidos que se usan como antígeno. Estos
son partes de una proteína que son los epitopes
(determinante antigénico) de un antígeno. Cada
una de sus partes que interactúa con el anticuerpo
monoclonal se llama epitope.
La reacción que se da entre el anticuerpo y el
epitope depende de este último, ya que son
regiones que conforman una estructura. Hay dos
casos, el de la derecha esta con una apertura de
aminoácidos llamado conformacional, en cambio a
la izquierda el epitope es lineal en este caso no
basta con un péptido.
No se puede inyectar un péptido directo, sino que
se organizan en estructuras de orden superior, ya
que se degradan y no tendrían suficiente dosis
para el tratamiento. Así se le agrega otras
proteinas o se utilizan partículas de oro para que
se unan los péptidos por enlaces covalentes,
quedando mas concentrados frente al sistema
inmune. También esta el caso de usarlo con otras
moléculas químicas con el mismo fin que los otros
El esquema de arriba muestra los pasos a seguir
para generar una vacuna peptídica
 Vacunas de subunidad
Es una proteína entera, pero siendo una
subunidad de un microorganismo patógeno. Se
necesita producir de manera recombinante para
formalar una mezcla como vacuna.
Los epítopos (aquellas partes de la proteína
responsables de interacción con anticuerpo)
reconocidos por los anticuerpos neutralizantes, se
encuentran generalmente en proteína de la
superficie del organismo patógeno.
Se llaman así porque son una parte del
microorganismo patógeno. La estrategia se basa
en producir los antígenos críticos o neutralizantes
del patógeno en forma recombinante e inyectarlos
al paciente

Lo que es clave es encontrar los antígenos que
producen la respuesta inmune protectora.
Un ejemplo es la vacuna contra el virus papiloma
humano.
 Vacunas de DNA
Las vacunas de ácidos nucleicos, siendo las mas
estudiadas las de DNA. A diferencia de la
subunidad, en vez de usar la proteína como
agente, se usa el gen, de manera que se produce
la proteína en la misma célula.
En la misma categoría están las vacunas de RNA.
Se inyecta el gen que codifica el antígeno. Este
fue clonado en un vector.
Una vez la vacuna entra al individuo se produce la
proteína y tiene que ser degradada en fragmentos
pequeños y enviada a la célula presentadora. Así
el antígeno queda expuesto a la superficie y el
sistema inmune produce la respuesta inmune
Las vacunas de mRNA se están estudiando hace
30 años. Estas consisten en una capa lipídica (en
el caso de las del covid) que protegen al RNA
mensajero. En este caso se salta un paso, ya que
el transcrito ya esta listo y solo hace falta traducir.
 Vacunas vivas recombinantes
Este tipo de vacunas son microorganismos, no
partes de proteína, sino que completos. Pueden
ser los patógenos, pero se atenuaron
genéticamente para que tenga factores de
patogenicidad y pueden ser no patógenos que son
usados como vectores que transporte y expresan
el gen de una proteína de un patógeno que induce
la producción de anticuerpos protectores en el
organismo vacunado.
Atenuarlo genéticamente es eliminar toda la parte
del gen que tiene asociada la patogenicidad. La
ventaja de que sea viva es que necesita menos
ayudante que las anteriores. Así va a ser mucho
más inmunogénica, ya que se reproduce.
Se usan microorganismos como vectores, los
cuales no son patogénicos. Como por ejemplo
esta la vaccinia y adenovirus que son virus y
también por el lado de bacteria estan los vectores
bacterianos, provocando una expresión de
antígenos de bacterias patógenas en la superficie
de bacterias no patógenas.
Se toma el gen del antígeno (proteína que induce
la mejor respuesta inmune) y la introducen en un
hospedero y luego se inserta en la vacuna. Así se
usan como transporte.