EXTRACCION DE RNA

A PARTIR DE LINFOCITOS

1. INTRODUCCIN
En los organismos celulares el ARN es la molcula encargada de dirigir la
sntesis de protenas, pues aunque el ADN es el que contiene la informacin
que determina la estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN
para traducir esta informacin y producir las protenas necesarias para el
desarrollo y actividades de la clula.
La mayor dificultad en la extraccin del ARN es evitar la contaminacin con
RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores para su funcin.
Por lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-piro
carbonato (DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificacin
covalente
2. OBJETIVOS
Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extraccin de ARN
Adquirir conocimiento bsico para el manejo y cuidado de ARN extrado
3. PROCEDIMIENTO:
Son dos partes:
-

Purificacin de linfocitos
Extraccin de ARN propiamente dicho

Purificamos la muestra porque los eritrocitos contaminan la muestra

Cuando se extrae RNA hay algunas diferencias respecto a la extraccin de
DNA,:
En este caso nos interesa inhibir la RNAsas, estas enzimas no se inhiben
con EDTA, asi que utilizamos fuertes agentes desnaturalizantes de protenas
como el tiozianato de guanidina, B mercafto etanol, estos dos son los que
inhiben a las RNAsas y tambin degradan protenas
Otra diferencia, aqu no se utiliza una reaccin en base a SDS como en la
extraccin de DNA, aqu se utiliza el TRIZOL (contiene fenol y los reactivos
como tiozianato de guanidina), el fenol se encarga de lisar las clulas, es un
solvente orgnico que disuelve todos los lpidos de membrana, el tiozianato
inhibir las RNAsas,

 Todo el proceso de extraccin se hace en hielo de preferencia ya que la

temperatura ambiente puede degradar el RNA, puesto que este es ms fcil
de degradar.
Todo el material a utilizar tambin debe ser tratado, en este caso con
dietilpirocarbonato, este elimina las RNAsas del material que se utiliza, las
RNasas estn presentes porque son muy difciles de eliminar, inclusive el
agua destilada tambin tiene que estar tratada con dietilpirocarbonato.
El RNa que se obtiene se tiene que guardar en agua libre de RNAsas , ya
no en buffer TAE, sino en buffer libre de RNAsas, esas son las principales
diferencias
Una vez extrado el RNa, se recomienda convertirlo a cDNA, si no es posible
debemos guardarlo a una baja temperatura, porque uno extra RNA para
convertirlo en CDNA, para hacer la tcnica de RT PCR, el cDNA es mucho
ms estable, no necesita condiciones tan especiales de conservacin.
.
Se extrae sangre

Se agrega suero fisiolgico en proporcin 1:1

Esta sangre debe obtenerse con un anticoagulante

Luego de la dilucin con el suero preparamos la gradiente de densidad, aqu se

utiliza un reactivo llamado FICOL, que permite separar las clulas mononucleares
de las clulas polimorfo nucleares y tambin de los eritrocitos, el FICOL se utiliza
para crear la gradiente de densidad

 El FICOL tiene una densidad intermedia entre los mononucleares y los polimorfo
nucleares, por lo tanto se coloca en medio y los separa
Preparamos esta gradiente colocando en otro tubo el FICOL
Sobre ese FICOL agregamos la sangre diluida previamente, agregamos con
cuidado para que no se mezcle, el ficol tiene mayor densidad

Centrifugamos a 2000 revoluciones por 20 min, por esta centrifugacin las clulas
se van a colocar a distinta altura de acuerdo a su gradientes de densidad,
las de menor densidad estarn arriba de un color medio amarillo,

el plasma y las plaquetas arriba por ser ms livianos

luego sigue la capa de clulas mononucleares,
de las clulas
mononucleares el 95% son linfocitos, en realidad hay monocitos y linfocitos
Los polimorfo nucleares y los eritrocitos son los mas pesados
Cada grupo se ubica de acuerdo a su densidad, para que ocurra esto es
importante la fuerza de centrifuga, como mximo 2000 revoluciones, tambin se
pueden utilizar 1500 revoluciones

 Luego se separa la capa de linfocitos, y se pasa a otro tubo limpio

Se lava las clulas utilizando suero fisiolgico, para retirar el FICOL que est
contaminando
Finalmente centrifugamos a 4000 revoluciones
Obtenemos el precipitado de linfocitos a partir de las cuales
Retiramos el sobrenadante y agregamos el TRIZOL (directamente sobre el
precipitado de clulas) para hacer la lisis de la Clulas e inhibir la RNAsas
Colocamos el tubo en hielo para mantener el RNA integro, la lisis se realiza por
pipeteo, hasta que desaparezca el precipitado de clulas
Agregamos cloroformo y dejamos 10 minutos adicionales en hielo

Se centrifuga
Se consigue separar en fase:
- acuosa solo con RNA
- interfase con protenas y carbohidratos
- Orgnica aqu est el reactivo TRIZOL y el cloroformo, lpidos tambin.
Separamos la interfase a otro tubo y agregamos isopropanol frio para precipitar el
RNA

 Luego centrifugamos
Tenemos el RNA precipitado, eliminamos el sobrenadante y
Realizamos lavados (2) con etanol al 70%

El RNA precipitado se suspende en agua libre de RNAsas, es agua destilada

tratada con dietil pirocarbonato que elimina las RNAsas
Adicionalmente a 280 y a 260, analizamos con 230 nm es para determinar si an
queda algo de contaminacin con el TRIZOL.
4.

BIBLIOGRAFIA:
Revista Nature Protocolos Aos 2009-2013
Almonacid, C Pinilla G. Introduccin al anlisis Bioqumico y a sus mtodos de
separacin. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca . 2008

ANALISIS DE RNA

INTRODUCCIN:
Son mltiples los factores que pueden afectar el rendimiento y la preservacin del
ARN, por lo que el anlisis integral de su cantidad y calidad se hacen
imprescindibles para llevar a cabo la transcripcin inversa y las posteriores PCRs,
de manera exitosa
Existen diferencias a comparacin de anlisis del DNA
Para la pureza:
Se considera un cociente ms adicionalmente al cociente 260/280
260/280 1.7
El cociente de la abs 260/230
La absorbancia de 230 nos permite determinar la contaminacin por el
TRIZOL y sus componentes
Para considerar que est libre del TRIZOL debe ser 1,5
Concentracin:
la absorbancia de 1 a 260 nm corresponde a 40ug por

El volumen final / el volumen inicial es la dilucin

El valor de dilucin obtenido se multiplica por el resultado de la regla de tres
Integridad:
los resultados deben ser dos bandas
No se ha degradado el RNA, sino se identifica el RNA ribosomal
Se considera que una muestra de RNA esta integra si es que aparecen dos
bandas, una de 28s y otra de 18 s, los otros tipos de ARN tambin estn
presentes pero en una concentracin baja que a veces no se detecta por
electroforesis, lo que nos interesa es que haya RNAm.
Las dos bandas aparecen porque el RNA ribosomal es siempre constante y
siempre aparece, una de las bandas por lo general es el doble de gruesa que la
otra, si aparece una sola banda no es una muestra integra, si aparecen