TALLER-INFORME EXTRACCIÓN DNA

ANGIE PAOLA CANO AGUDELO

cc. 1017240637
ANGIE PAOLA VALENCIA HINESTROZA
cc. 1017268494

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
DOCENTE: ELKIN LEANDRO ESCOBAR

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y ALIMENTARIAS

QUÍMICA FARMACÉUTICA

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
MEDELLÍN

INTRODUCCIÓN
 La obtención de ácido desoxirribonucleico (ADN), es el punto de partida para la mayoría de
análisis genéticos; incluso contando con pequeñas cantidades de ADN, es posible amplificar
genes específicos in vitro a través de la reacción en cadena de la polimerasa.Esta
revolucionaria técnica le valió a su inventor, Kary B. Mullis, el premio Nobel de química en
1993.
El presente informe- taller está hecho en base a la extracción de ADN de muestras
vegetales.

RESULTADOS

Se realizó un procedimiento de extracción de ADN de 9 muestras de material vegetal. A

continuación, se muestran los valores obtenidos luego de la extracción y purificación de
ADN, mezcla de reacción para la PCR y la fotografía del Gel de electroforesis.

Análisis por espectroscopia UV de la muestra de DNA obtenido en la extracción.

Grupo Muestra Abs λ (260 nm) Abs λ (280 nm) A260/A280 Pureza % [ ] DNA ng/μL
1 Arveja 0,817 0,436 1.87 89.1% 40.85

2 Arveja 0,113 0,062 1.82 86.7% 5.65

3 Arveja 0,075 0,062 1.21 57.6% 3.75

4 Cebolla 0,075 0,051 1.47 70% 3.75

5 Cebolla 0,081 0,061 1.33 63.3% 4.05

6 Cebolla 0,035 0,020 1.75 83.3% 1.75

7 Banano 0,937 0,481 1.95 92.8% 46.85

8 Banano 0,901 0,405 2.22 105.7% 45.05

9 Banano 0,922 0,473 1.95 92.8% 46.1

La determinación de la pureza del material vegetal se realiza con la siguiente ecuación:

Abs 260nm/Abs 280nm = pureza DNA

La determinación de la concentración del material vegetal se realizó con la siguiente

ecuación (asumir un factor de dilución de 10 y 50ng/ul es una K):

Mezcla de reacción para la PCR

Componente Volumen por reacción Función del
componente
Agua MIlli-Q La necesaria para Ayuda a prevenir la
 llegar a 100µl/tubo contaminación
cruzada. Libre de
DNasas y RNasas.
Buffer 10X 10 µl Proporciona
concentraciones
óptimas de iones,
potasio y magnesio que
actúan con cofactores
de la taq polimerasa y
es calibrada a un pH
superior a 8.
Primer 5´ 50 µM 1µl Localizar y unirse a sitios
complementarios del
ADN desnaturalizado.
Amplifica los 10
primeros nucleótidos.
Primer 3´ 50 µM 1 µl A partir de este se crea
una cadena
complementaria a la
molde gracias al DNA
polimerasa.
dNTP´s 10mM 2 µl Síntesis de la cadena
de ADN molde.
ADN molde 20 µl Es el ADN proveniente
del organismo que se
quiere analizar.
Taq Polimerasa 5 U/µl 1 µl Restituye la doble
cadena de ADN
mediante su síntesis a
partir de un punto
determinado.

Fotografía del gel de electroforesis

Preguntas guía y taller.

1. Completar la tabla de muestras de DNA obtenido de la extracción.
2. Consultar las tablas de relación de absorbancias A260/A280 para estimar la pureza
del ADN.

3. Completar la tabla de Mezcla de reacción para la PCR

4. Mencione los 3 pasos importantes en el proceso de extracción y purificación de ADN

y mencione el reactivo clave en cada uno de ellos y cuál es su función.

Lisis de la membrana celular

La primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la membrana

celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con
el tampón de extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las
membranas biológicas presentan la misma estructura general, integrada por
moléculas de lípidos y de proteínas, unidas por interacciones no covalentes.
El detergente (CTAB) El CTAB es un detergente catiónico que tiene la
propiedad de precipitar ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos en soluciones
de baja concentración iónica. Bajo estas condiciones las proteínas y los
polisacáridos neutros permanecen en solución. En soluciones de alta
concentración iónica el CTAB forma complejos con las proteínas y
polisacáridos pero no precipita ácidos nucleicos [4]. El EDTA es un
componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El Tris-
HCl confiere a la solución la capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o
superior daña el ADN). Una vez que se han roto las membranas de la célula y
de los orgánulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y
los cloroplastos), se purifica el ADN.
 Extracción

En esta etapa, se separan los complejos formados por los ácidos nucleicos y
el CTAB de los polisacáridos, los compuestos fenólicos, las proteínas y los
demás lisados celulares disueltos en la solución acuosa. El cloroformo
desnaturaliza las proteínas y facilita la separación de las fases acuosa y
orgánica. Si es preciso, la extracción con cloroformo se realizará dos o tres
veces, con objeto de eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa.

Precipitación

En esta última etapa se separan los ácidos nucleicos del detergente, para lo
cual la solución acuosa se trata primero con una solución de precipitación
compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentración elevada (NaCl
> 0,8 M). Una alta concentración salina es necesaria para que se forme un
precipitado de ácidos nucleicos. En estas condiciones, el detergente, que es
más soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras
que los ácidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70
% permite una mayor purificación o elución de los ácidos nucleicos de la sal
residual

5. Mencione las fases de la PCR y a que tiempo y temperatura típica es utilizada cada
una.

● Inicio: Consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si

se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9
minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por
calor.
● Desnaturalización: En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos
cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes
modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La
temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo,
de la proporción de guanina y citosina que contenga la cadena, como también del
largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR,
serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la
desnaturalización.
● Alineamiento o unión del cebador: A continuación, el cebador se unirá a su
secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la
temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el
alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión
ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la
secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el
cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la
región de la molécula que va a ser amplificada.
 ● Extensión o elongación de la cadena: En esta etapa actúa la polimerasa, tomando
el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador
como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN.
La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo
los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con
el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La
temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq,
la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de
extensión depende tanto del ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento
de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su
temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimeriza mil bases en un minuto.
● Elongación final: Se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15
minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de
cadena simple restante sea totalmente ampliado.
● Conversación: Este paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo
indefinido para conservar la reacción a corto plazo.

6. ¿Qué otras macromoléculas pueden ser separadas por electroforesis en gel? ¿Cuál
es el polímero más utilizado para cada una de esas macromoléculas?

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u

otras macromoléculas, como ARN y proteínas) con base en su tamaño y carga, las
moléculas se desplazarán por el gel en diferentes direcciones o a distintas
velocidades, con lo que se separan unas de otras.La separación de moléculas en la
electroforesis se basa en la carga (sobre lo que se aplica la fuerza) y la sección
transversal efectiva de la molécula en el estado que se encuentra: plegada,
desnaturalizada, ligada a otras moléculas, etc.

Los geles para separar ADN suelen estar hechos de un polisacárido llamado
agarosa, que se consigue como hojuelas secas pulverizadas. también se suele
utilizar.

● Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la
celulosa.
● Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción;
baja tinción de fondo; es posible transparentar o disolver para detectar y recuperar,
respectivamente, los componentes separados.
● Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón caliente
(se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.
● Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de
acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y su proporción se
consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.

7. ¿Además del azul de bromofenol, que otro colorante se utiliza en los buffers de
carga?

También es usado el xileno-cianol, este es un compuesto coloreado y con carga, utilizado

para comprobar el progreso de la electroforesis. En la electroforesis este compuesto se
mueve aproximadamente como las moléculas de DNA de 9000 pb. Y como su color azul es
bien visible, permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas grandes
de DNA no se hayan salido del gel.

CONCLUSIÓN

- Al realizar el procedimiento adecuadamente, pudimos apreciar que las fibrillas de

ADN comenzaron a salir, de un color blanco precipitado por sobre el alcohol (mezcla
Heterogénea). Con esta práctica casera podemos saber cómo es el procedimiento
del extracto del ADN, así como si se estructura de una forma fácil y sencilla.

BIBLIOGRAFÍA

- Aras S., A. Duran y G. Yenilmez. 2003. Isolation of DNA for RAPD analysis from
dry Leaf material of some Hesperis L. Specimens. Plant Molecular Biology 21:
461a–461f.
http://www.scielo.org.pe/pdf/rmh/v14n4/v14n4cc03.pdf