INFORME DE LABORATORIO

PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE MÉTODO DE COLUMNA

CAMILO ERNESTO SALINAS GONZALEZ

JUAN DANIEL OCHOA TORRES

PROFESOR:

BELFRAN ALCIDES CARBONELL MEDINA

BIOQUIMICA MEDICA II (BMO42-2)

INSTITUTO TECNOLÓGICO

METROPOLITANO (ITM) MEDELLÍN

2022
 INTRODUCCION

El ADN, o ácido desoxirribonucleico, es el material genético que se encuentra en las

células de todos los organismos. Está compuesto por nucleótidos unidos entre sí

(Adenina, Timina, Guanina, Citosina) (figura 1A). El ordenamiento y secuencia de los

nucleótidos forma un polímero de ADN de doble cadena, el cual se traduce en un ARN

mensajero (ARNm), este ARN contiene la información para generar una o varias

proteínas utilizando diversos ARNs como intermediarios como los ARN de transferencia

(ARNt) y ARN ribosomales (ARNr) (figura 1B). En células eucariotas la mayor parte del

ADN se localiza en el núcleo que está rodeada por una bicapa lipídica. Sin embargo, una

pequeña cantidad de ADN también se puede encontrar en otras estructuras celulares,

como en la mitocondria en animales o cloroplastos en plantas

 OBJETIVOS:

- Comprender el fundamento de los métodos de purificación de ácidos nucleicos

mediante el método de columna.

6.1. Explique el efecto de cada uno de los componentes del Buffer de Lisis en

la etapa de homogenización del ADN.

Para la liberación de los componentes internos de la célula, se hace a través de un

Buffer de Lisis, el cual, dentro de este se encuentra: Un detergente, un agente (Tris

HCl), y un Quelante (EDTA).

El detergente, quien se encarga del rompimiento de la membrana para que así se

liberen todos los componentes de la célula, luego, este se combina con un agente

(Tris HCl), encargado de amortiguar y estabilizar el PH; Dentro del Buffer, también

se encuentra un quelante (EDTA) que es quien permite secuestrar los Cationes

(Calcio y Magnesio) que son necesarios para que las enzimas (DNasa y RNasa)

actúen sobre ácidos nucleicos, de tal forma que si se secuestran los iones de Calcio

y Magnesio se puede disminuir la actividad de las enzimas.

6.2. Realice un esquema/dibujo y un diagrama de flujo del procedimiento donde

explique el fundamento bioquímico de cada una de las etapas de la extracción

de ADN.
 6.3. Explique el fundamento bioquímico que permite la Elución de ADN de la
columna de sílica-gel

El fundamento bioquímico que permite la elución de ADN de la columna de gel silica- gel es
porque los Ac.nucleicos están recubiertos de una capa de agua que mantienen su
solubilidad en soluciones acuosas. • Con la adición de iones caotrópicos, se destruye esta
capa hidratante, y se crea un entorno hidrofóbico, lo cual permite que el ADN se una a la
membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas y otros contaminantes no
se unen y son eliminados durante los pasos de lavado. Los ácidos nucleicos se eluyen de la
membrana utilizando tampones de elución con ↓ [sales] (ligeramente alcalinos) o agua, que
permiten recuperar la capa hidratante liberándonos de la membrana, sin afectar los Ac.
6.4. Realice una comparación e indique las ventajas y desventajas entre el método
de separación de ADN mediante métodos de columna (en inglés: Spin Column),
y los métodos caseros de extracción de ácidos nucleicos como fenol-
cloroformo y Salting out. De una breve fundamentación de estos métodos.

- Método de columna (Spin Column)

Es un método de extracción en fase sólida para purificar rápidamente los ácidos

nucleicos. Este método se fundamenta en que el ácido nucleico se une a la fase

sólida de sílice bajo ciertas condiciones. El principio de extracción de este tipo de

método se basa en la capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos en una

columna de sílice ante la presencia de altas concentraciones de sales

caotrópicas.

- Fenol-cloroformo.
La extracción con solventes orgánicos se realiza mediante la mezcla del lisado
celular con fenol, cloroformo y alcohol isoamílico para la separación de los ácidos
nucleicos, y las proteínas.
- Salting out.
Es un método para separar proteínas basadas en el principio de menos
solubilidad de las proteínas en altas concentraciones de sal. La concentración de
sal necesaria para la proteína a precipitar difiere de proteína a proteína.
 COMPARACIÓN: Ventajas, y desventajas.

Ventaja Desventaja
• Este método permite • El rendimiento y la calidad del
Método de obtener muestras de una gran ADN (o ARN) obtenido depende
columna (Spin pureza. de la cantidad y calidad de la
Column) • Las muestras obtenidas
muestra de partida.
• Amplifica por PCR fragmentos
presentan una integridad muy alta.
de ADN de gran tamaño.
• Alto rendimiento. • Restos de solventes
Fenol- Cloroformo • Puede ser utilizado para la orgánicos
obtención de ADN de diferentes contaminan la muestra.
tipos de muestra. • Restos de fenol o cloroformo
pueden afectar a las relaciones
de absorbancia indicativas de la
pureza de la muestra.
Salting out. • La pureza del ADN obtenida con
el método de precipitación por
sales es muy alta.
• Las muestras de ADN obtenidas
con este protocolo se pueden
considerar muestras de una
integridad muy alta.

6.5. Explique cómo se puede analizar la calidad y pureza del ADN purificado

¿Cómo se puede asegurar que el producto final de extracción es Acido

desoxirribonucleico (ADN) y no Ácido ribonucleico (ARN)?

A través de espectrofotometría se consigue determinar la concentración, y pureza

de una muestra de ADN. Fundamentándose en la capacidad de absorción de un

compuesto presente en una solución a una longitud de onda determinada. Se puede

asegurar que el producto es ADN, y no ARN mediante las bases nitrogenadas de

ambos nucleótidos. Si posee Timina (T) es ADN, por el contrario, posee Uracilo (U)

es ARN.
6.6. Describa cómo se realiza la cuantificación de ácidos nucleicos mediante

espectrofotometría ¿Cuál es el componente del ADN que absorbe a la longitud

de 260nm y para que puede servir esta característica en la cuantificación del

ADN? ¿Qué sustancias absorben a 280nm? ¿Qué se puede decir si un

extracto de ADN presenta un radio de absorbancia 260/280:>1.8?

El espectrofotómetro consiste en la transmisión de la luz a través de una solución

para establecer la concentración de un soluto presente en la misma. Funciona

conforme a un principio inteligible: Con una radiación luminosa irradia una muestra

de longitud de onda conocida, y mide la energía luminosa dada con una célula

fotoeléctrica ubicada detrás de la muestra. La absorción máxima del ADN y ARN

corresponde a 260nm, y de las soluciones proteicas a 280nm. Debido a que las

soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280nm, y las proteínas

tienen un comportamiento similar a 260nm. Los coeficientes de los valores descritos

proporcionan una estimación del grado de pureza de los ácidos nucleicos

aproximadamente entre 1.8 y 2.0

6.7. Describa algunas aplicaciones biomédicas de la extracción de ácidos nucleicos

- Diagnósticos médicos: El diagnóstico de ciertas condiciones médicas a menudo

se pueden hacer a partir del ADN extraído de un paciente, también es común
probar para ver si una persona es portadora de una enfermedad en particular, pero
sin tenerla.
- Fabricación de farmacéuticos: Se utiliza como un paso inicial en la fabricación de
un número de productos farmacéuticos.
- Verificación de identidad: La verificación genética ha trabajado tanto para colocar
a una persona en la escena de un crimen, como para exonerar a las personas
 condenadas erróneamente por un delito.

CONCLUSIÓN

Los métodos de extracción del ADN permiten la obtención de ácidos nucleicos

purificados a partir de diferentes fuentes para así después lograr conocer su estructura

y poder realizar análisis específicos de modificaciones genéticas. Para la extracción de

los ácidos nucleicos, es preciso provocar una lisis celular, romper las membranas

celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células; Tras la lisis celular, los

restos de células se eliminan fácilmente por una precipitación con altas

concentraciones salinas, y así se pueda sacar el ácido nucleico con sales fácilmente;

Se remueven los restos de sales por medio de un lavado (Isopropanol 100% y

Etanol70-95%), y se rehidratan los ácidos nucleicos (Buffer TE); Finalmente, estos

quedan listos para ser almacenados.

REFERENCIAS

Alejos Velázquez, L. (2010). Extracción y purificación de ADN. Universidad

Nacional Autónoma de México.

Banco Nacional de ADN Carlos III. (2012). Programa Control de Calidad de Muestras.
Universidad de Salamanca.
Biocell Science. (2016). Obtenido de https://biocellsci.com/portfolio_page/buffer-tae-tris-
acetate- edta/

Alberto Checa Rojas. (2016). Extracción de ADN. 2022, Marzo 10, Conogasi.org Sitio
web: https://conogasi.org/articulos/extraccion-de-adn/