TEMA-18.

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Biología Molecular

2º Grado en Farmacia

Facultad de Farmacia
Universidad Complutense de Madrid

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 TEMA 18. TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Vamos a ver aislamiento, cuantificación y electroforesis.
AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
1. Lisis: romper las células y liberar los orgánulos usando varios mecanismos (moler,
triturar, picar, cambios de presión, choque osmótico, congelación y descongelación).
Las células se lisan en una solución que suele ser una solución isotónica:
- Lisozima en bacterias.
- SDS.
- NaOH.
- EDTA.
- Agentes desnaturalizantes.
- Proteinasa K: para degradar las proteínas.
Estos componentes facilitan la lisis y la extracción de los ácidos nucleicos.
2. Desproteinización: se subdivide en 2 pasos:
- Proteólisis: degradación de proteínas mediante proteinasa K.
- Extracción del DNA mediante solventes orgánicos como el fenol. Las proteínas
van a la fase orgánica, y los ácidos nucleicos quedan en la fase acuosa.
3. Precipitación: precipitar los ácidos nucleicos para concentrarlos y resuspender en
un buffer. Se hace con isopropanol o etanol al 70% en presencia de sales (acetato
sódico). Esto hace que el DNA o RNA precipite. Se lava con etanol para obtener los
ácidos nucleicos purificados. Se lavan en un buffer.
Aquí se obtiene DNA total o RNA total.
PURIFICACIÓN DE MRNA A PARTIR DE RNA TOTAL
A partir de RNA total por cromatografía de afinidad: columnas rellenas de
matriz unida a ligandos específicos.
mRNA eucarióticos maduros tienen colas de PoliA y la resina se une a sus
ligandos específicos de PoliU y PoliT.
También de baja fuerza iónica eluye mRNA.
Se utiliza la cola poli A para aislar los mRNA. Se utilizan unas resinas que
contienen polímeros poliU o poliT, para que se produzca una hibridación.
Se lava, y los mRNA quedan unidos a la resina.
Esto en rRNA y tRNA no, ya que no tienen la cola de poli A.
VALORACIÓN DE LA CANTIDAD Y PUREZA
Cuantificación del material después del aislamiento para cuantificar la cantidad y la
pureza mediante una lectura espectrofotométrica a 260nm, teniendo en cuenta que:

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 - 1 unidad de densidad óptica (DO) a 260nm corresponde con 50 µg/mL de DNA.
- 1 DO corresponde a 40 µg/mL en RNA.
- 1 DO corresponde a 20 µg/mL en oligonucleótido de cadena sencilla.
La pureza se determina calculando el valor de la reacción: DO260nm/DO280nm. En
280nm los aa tienen su pico. Lo óptimo es 1,8-2.
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Para separar fragmentos o moléculas de DNA o RNA por tamaño y por carga.
Las moléculas de DNA o RNA pueden separarse linealmente cuando sometidas a un
campo eléctrico, y se les hace pasar por una matriz, que es un material inerte y
poroso.
El DNA está cargado negativamente debido a los grupos fosfato de pH 8.
Cuando sometemos a las muestras de DNA a un campo eléctrico, los DNA se mueven
desde la carga negativa hasta la carga positiva debido a un flujo de corriente
electrónica. Como el material es una especie de matriz, los fragmentos pequeños se
mueven más rápido y llegan antes a la parte positiva del gel, mientras que los grandes
no pasan y quedan al origen.
COMPOSICIÓN DE LA MATRIZ:
2 tipos:
- Agarosa: polisacárido de galactosa y derivados entrecruzados. Tamaño de los
poros variables para que los ácidos nucleicos se separen en función de su
tamaño. Electroforesis horizontal. Alta capacidad de separación y baja
resolución.
- Poliacrilamida: mezcla de polímeros de acrilamida y bisacrilamida.
Tamaño de poroso variable. Es electroforesis vertical. Baja cantidad de
separación y alta resolución.
La agarosa se pone con tampón, se hierve, y se pone en el molde de metacrilato.
Se pone el tampón (TAE o TBE) de pH 8 que hace que la carga neta de DNA sea
negativa, permitiendo que migre del cátodo (-) al ánodo (+).
Parámetros que afectan a la migración del DNA en genes de agarosa:
- Tamaño de las moléculas a separar: Las moléculas migran con una velocidad
inversamente a su tamaño. A mayor tamaño menos se mueven. Se pone un
marcador.
- Concentración del soporte: a mayor concentración, menor movilidad.
- Conformación del DNA: en DNA circulares. El superenrollamiento hace que se
muevan más rápido.
- Intensidad de corriente aplicada: la velocidad de migración es mayor a mayor
voltaje.

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 - Composición del tampón: la velocidad de migración depende de la fuerza
iónica. Los tampones más usados: Tris-acetato (TAE) y tris borato (TBE). Se
ajustan a un pH 8, que es en el que los grupos fosfato de los ácidos nucleicos
tienen una carga negativa. Queremos que los ácidos nucleicos estén
igualmente cargados para separar por la masa y no por la carga. Cuando
apliquemos un campo eléctrico separamos por la masa y no por la carga,
porque todas las moléculas de DNA o RNA van a tener la misma carga por los
grupos fosfato.
La visualización se lleva a cabo empleando bromuro de etidio, un compuesto
fluorescente a la luz ultravioleta (absorción a 330nm). Es un intercalante, se intercala
entre las moléculas de doble cadena.
Alternativas al bromuro de etidio, ya que es tóxico: GelRed.
FRAGMENTACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. MAPA DE RESTRICCIÓN
La mayor parte de moléculas de DNA son enormes, por lo que para estudiar un gen
individual o una región se rompe en fragmentos para que sea más manejable.
1. Métodos físicos:
- Fuerza de cizalla: con la pipeta moviendo arriba y abajo hasta romper el DNA.
- Ondas de presión por ultrasonidos (sonicación) para romper los enlaces
fosfodiéster y fragmentar el DNA en fragmentos más pequeños.
2. Métodos químicos:
- Hidrólisis acida:
 Débil: rompe enlaces glucosídicos.
 Fuerte: rompe enlaces glucosídicos y fosfodiéster.
- Hidrólisis básica: es sensible el RNA. El DNA es inmune a esta hidrólisis, permite
obtener DNA sin RNA. El RNA se degrada, y así se obtiene el DNA.
3. Métodos enzimáticos:
- Exonucleasas: cortan nuestros ácidos nucleicos por sus extremos (3´ o 5´).
- Endonucleasas: cortan nuestros AN dentro de la doble cadena. 2 tipos:
 Enzimas de restricción.
 Endonucleasa CRISPR/Cas9.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Endonucleasas muy específicas: reconocen determinadas secuencias y hacen un corte
del DNA en una secuencia muy específica.
Se obtuvieron de bacterias. Dentro de bacterias responden a un ataque
viral: viene un virus, que introduce su material genético, la bacteria
responde con las enzimas de restricción, y corta la molécula del DNA

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 del fago. La bacteria se protege porque metila las regiones para que la enzima de
restricción no las corte.
Además de fragmentar el DNA, las enzimas de restricción permiten desarrollar la
tecnología del DNA recombinante.
Enzimas tipo II:
- Actividad endonucleasa (no metilasa: proteína independiente).
- Cofactor: magnesio dependiente.
- Reconocen secuencias (sitios de restricción) palindrómicas específicas de DNA.
Punto de rotura característico en la secuencia reconocida.
- Hay cientos comercialmente disponibles.
Secuencias palindrómicas: secuencias que se leen igual en
sentido 5´ al 3´. Esta secuencia es la reconocida por la enzima de
restricción Eco RI. EcoRI hidroliza y corta la secuencia. El enlace
hidrolizado es el 3´ fosfato, por lo que el fosfato queda unido al
5´, dejando extremos 3´OH y 5´ fosfato. Esta reacción no
necesita ATP, y deja 2 fragmentos.
Cuando la enzima de restricción corta deja los 2 extremos, que los vamos a llamar
extremos cohesivos.
Ruptura de 2 enlaces fosfodiéster (doble hebra del DNA), lo que da lugar a 2 extremos
de DNA:
- Romos: los enlaces rotos coinciden.
- Cohesivos/protuberantes: dejan entre 2 y 4 NT desapareados en una cadena.
Tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo.
Esto permite juntar moléculas de DNA que tenían un origen, y juntarlas con otro
origen.
Identifica secuencias específicas dentro de un DNA de doble cadena, y dejan extremos
cohesivos que facilitan la ligación, la clonación y la formación de DNA recombinante.
Nomenclatura: 3 letras en cursiva que proceden del nombre científico de la bacteria.
EJEMPLO: EcoRI:
- Eco viene de E.coli.
- R viene de la cepa.
- I: número romano si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma
especie.
APLICACIONES DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
- Hacer un mapa de restricción.
- Fragmentar el DNA genómico para su separación por electroforesis y Southern
blot.

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 - Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southern
y Northern blot.
- Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados,
creación del DNA recombinante.
- Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP).
MAPAS DE RESTRICCIÓN
Tenemos un fragmento de DNA en el que se colocan de manera ordenada las
secuencias y los sitos donde unas enzimas de restricción van a cortar.
ELABORACIÓN DE MAPAS FÍSICOS O MAPAS DE RESTRICCIÓN:
1. Cortar el DNA con varias enzimas de restricción mediante digestión sencilla o
doble.
2. En base a los tamaños de los fragmentos obtenidos mediante electroforesis en gel
de agarosa se puede conocer:
- El número de puntos de corte para esos enzimas.
- La distancia entre esos sitios de reconocimiento.
- Su disposición relativa en la molécula.
Digestión con:
- BglI: obtenemos 2 fragmentos
- ScaI: 1 fragmento.
- Bg lI y ScaI.
SISTEMA CRISPR CAS9
No cae en el examen. Sistema de protección bacteriana frente a virus por
endonucleasas guiadas por una guía de DNA. El fragmento de DNA hibrida con una
región del DNA (20 pb), y una vez que se una produce el corte.

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