ESPECTROFOTOMETRÍA

LABORATORIO DE ESPECTROFOTOMETRÍA

LUISA BARRAZA

AURORA MERCADO

LUISANA MONTERROZA

KEISSA PELÁEZ

SHEYLA SMITH

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

MEDICINA

BARRANQUILLA D.E.

2024

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Introducción

La espectrofotometría es una técnica que se realiza con un espectrofotómetro, el cual permite

cuantificar la concentración de moléculas en una muestra mediante la medición de la
absorbancia de la luz. En este caso (analizar ADN), la espectrofotometría se emplea para
evaluar su pureza y establecer su concentración. Este procedimiento se fundamenta en la ley
de Beer-Lambert, que establece una correlación entre la absorbancia de la luz por parte de una
muestra y la concentración del compuesto que provoca dicha absorción. “La absorbancia de la
luz por una solución es directamente proporcional a la concentración de la sustancia
absorbente y al camino óptico a través del cual pasa la luz” (August Beer, 1852)
La absorbancia de la luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nanómetros (nm) se
utiliza para cuantificar el ADN y el ARN por la presencia de anillos en las bases nitrogenadas,
las cuales confieren una absorbancia máxima en esta longitud de onda. Cabe destacar que las
soluciones de ácidos nucleicos pueden contener contaminantes: proteínas y fenol, las cuales
afectan a la absorbancia.
En este informe, se evalúa la pureza de la muestra de ADN calculando el cociente entre las
absorbancias medidas a 260 nm y 280 nm (A260/A280). Valores de 1.8 a 2.0 indican una alta
pureza, mientras que valores más bajos sugieren contaminación con proteínas o fenol.

Materiales y Métodos

Materiales:

Tabla 1. Materiales para espectrofotometría.

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Métodos:

Figura 1. Diagrama de la metodología de espectrofotometría.

Resultados

Durante el procedimiento se tomaron 990 ul de solución GE buffer y 10 ul de la solución con

ADN. Adicional a esto una muestra de 1 ml con buffer para obviar la absorbancia del buffer y
solo quedarnos con la absorbancia del ADN.
Adicionalmente se calibró el espectrofotómetro a 260 nm y luego a 280, el rango de mayor
absorbancia del material genético de ADN, obteniendo los siguientes resultados:

Tabla 2. Absorbancia del ADN del cultivo de E. Coli.

Longitud de Onda (nm) Absorbancia

260 0,072
280 0,028

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Análisis de Resultados

En la espectrofotometría de ácidos nucleicos, las absorbancias a 260 nm y 280 nm son críticas

para evaluar la pureza y concentración del ADN en una muestra. La absorbancia a 260 nm
indica la presencia de ácidos nucleicos, mientras que la absorbancia a 280 nm se utiliza para
detectar la presencia de proteínas contaminantes.

La relación de absorbancia (A_ {260} /A_ {280}) es un indicador de la pureza del ADN. Un
valor de 1.8 se considera puro para el ADN, mientras que valores significativamente menores
pueden indicar contaminación por proteínas. En nuestro caso, la relación es (\frac {0.072}
{0.028} \approx 2.57), lo cual es inusualmente alto. Esto podría deberse a varias razones,
como:

Calibración del Espectrofotómetro: Asegurarse de que el espectrofotómetro esté calibrado

correctamente es fundamental. Un error en la calibración puede llevar a lecturas incorrectas
de absorbancia.

Interferencias en la Muestra: La presencia de otras sustancias en la muestra que también

absorben a estas longitudes de onda puede alterar los resultados. Esto incluye reactivos de
extracción de ADN o contaminantes químicos.

Técnica de Medición: La forma en que se maneja la muestra durante la medición puede

afectar los resultados. Las burbujas de aire, la suciedad en las cubetas o un volumen
incorrecto de muestra pueden causar lecturas inexactas.

Propiedades Ópticas del Buffer: El buffer utilizado puede tener sus propias propiedades de
absorbancia que necesitan ser consideradas. Por eso es importante medir la absorbancia del
buffer solo para restar este valor de las mediciones finales.

Concentración de la Muestra: Una concentración muy alta o baja de ADN puede llevar a
errores en la medición, especialmente si la muestra está fuera del rango lineal del
espectrofotómetro.

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Discusión

En base a los resultados obtenidos en la espectrofotometría de ácidos nucleicos, se observa

una variación significativa entre los diferentes grupos de trabajo del laboratorio, lo que
plantea importantes consideraciones sobre la metodología utilizada y las posibles
implicaciones en la calidad de las muestras analizadas.

En nuestro grupo (1) observamos valores de absorbancia relativamente bajos, especialmente a

260 nm, indicativos de una baja concentración de ADN en nuestra muestra analizada. Este
resultado puede atribuirse a varias causas, como la calidad de la extracción de ADN, la
presencia de contaminantes que interfieren con la absorción o incluso errores experimentales
durante el proceso de medición.
En cuanto, al grupo 2 mostró una absorbancia ligeramente más alta en comparación con
nuestro resultado. Específicamente, al utilizar cuarzo como material de muestra, se registraron
valores significativamente más altos de absorbancia. Pero con una variabilidad notable entre
las lecturas a diferentes longitudes de onda significativamente más altos de absorbancia. Esto
puede deberse a la concentración algo mayor de ADN. Sin embargo, es crucial considerar la
variabilidad en las lecturas de absorbancia a diferentes longitudes de onda, lo que puede
indicar la presencia de impurezas en la muestra que afectan la precisión de la cuantificación o
las diferencias en la sensibilidad de detección entre los materiales utilizados, así como
posibles efectos de la dispersión de la luz en los resultados obtenidos.
Por otro lado, el grupo 3 destacó por presentar los valores más altos de absorbancia, lo que
indica una concentración sustancialmente mayor de ADN en la muestra, en comparación con
los otros grupos. Este resultado puede atribuirse a una extracción más eficiente de ADN, una
menor contaminación de la muestra, o una mayor precisión en la técnica de medición.
Estas diferencias en los resultados de cada grupo muestran una variación en la concentración
de ADN entre los diferentes grupos de trabajo, lo que destaca la importancia de implementar
la estandarización de los procedimientos de medición y validar la precisión y exactitud del
método utilizado. Además, realizar controles de calidad rigurosos para garantizar la
consistencia y fiabilidad de los datos obtenidos en la espectrofotometría de ácidos nucleicos.

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Conclusión

En síntesis, el análisis realizado mediante el procedimiento de espectrofotometría de ácidos

nucleicos permitió observar que hubo una contaminación con un valor significativo de fenol
en la muestra de DNA, lo cual se refleja en la calidad de los resultados obtenidos. La
espectrofotometría es una técnica basada no sólo en la medida de absorbancia de la luz, sino
también en la transmitancia, lo cual nos permitió evaluar la concentración y pureza de ADN
en la muestra extraída. La diferencia entre transmitancia y absorbancia parte desde el punto de
la medición de la interacción de la luz con la muestra, puesto que la absorbancia cuantifica la
cantidad absorbida de luz, por otro lado, la transmitancia permite conocer la cantidad de luz
qué pasa a través de la muestra. En nuestro caso, la alta absorbancia a 260 nm y 280 nm nos
demuestra la presencia de fenol, por lo cual se ve afectada la pureza del DNA. Cabe destacar
que en este tipo de prácticas es de gran relevancia mantener protocolos estrictos en la
preparación de estas muestras, de este modo se considera indispensable implementar un
control de calidad con el fin de que no se vea afectado el resultado de la muestra, obteniendo
de esta forma resultados positivos y satisfactorios.

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Referencias Bibliográficas

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