Laboratorio 11: Cuantificación del ADN por los

Métodos en Gel de Agarosa y Espectrofotometría

Introducción

En Biología molecular, luego de haberse realizado la extracción de ADN O ARN, son necesarias
determinar la concentración promedio presentes en una muestra, además, del análisis de la calidad y
pureza de las moléculas obtenidas antes de proceder a realizar posteriores experimentos. Esto se
debe sobre todo porque las reacciones en las que se utilizan ácidos nucleicos (PCR, secuenciación,
digestión del ADN y RAPDs) suelen requerir cantidades y pureza particulares para un rendimiento
óptimo de dichas reacciones. Hasta la fecha, existen dos enfoques principales utilizados por los
científicos para cuantificar, o establecer la concentración de ácidos nucleicos (ADN o ARN) en una
solución. Ambos métodos presentan sus ventajas y desventajas. Los procedimientos utilizados para
determinar la concentración media de ADN o ARN son la de marcado por fluorescencia UV en
presencia de un colorante de ADN y la cuantificación espectrofotométrica. Actualmente también se
está implementando el método de la qPCR, para tal fin.

Cuantificación del ADN por el Método en Gel de Agarosa

La cuantificación del ADN en gel es una técnica utilizada en investigación para obtener una
estimación del tamaño del ADN en un gel de Agarosa. La técnica consiste en hacer migrar
moléculas de ADN a través de un medio de soporte y la posterior comparación de una cantidad
conocida de ADN contra una cantidad desconocida de ADN en un gel de agarosa. El gel se tiñe con
bromuro de etidio o cualquier otro tinte con propiedades quelantes (Gel Red o SYBR Green) La
intensidad en el brillo de un fragmento de ADN en particular (banda), asi como la distancia recorrida
en el gel son criterios utilizados para estimar la cantidad, tamaño y calidad de un fragmento en
particular al cotelario con una muestra conocida de ADN Ladder y luego es fotografiado al ser
observado a través de un transiluminador o un sistema de documentación de geles.

Cuantificación del ADN por el Método de Espectrofotometría

El método espectrofotométrico es uno de los más utilizados para cuantificar el ADN o el

ARN ya que estos al estar constituidos por bases nitrogenadas son capaces de absorber cierta
longitud de luz. Este método hace uso del análisis espectrofotométrico mediante un
espectrofotómetro que es un instrumento en el que se apoya la espectrofotometría para medir la
cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una solución muestra. Un
espectrofotómetro es capaz de determinar las concentraciones medias de los ácidos nucleicos ADN,
ARN, oligonucleótidos incluso mononucleótidos presentes en soluciones acuosas, en forma diluida o
sin diluir en una mezcla, así como su pureza al medir la absorbancia A (densidad óptica DO) de luz
ultravioleta (radiación no visible) o también puede realizarse en el intervalo de la longitud de luz
visible del espectro, Fig. 11.1.

La cuantificación del ADN por el método espectrofotométrico se basa en el principio de que los
ácidos nucleicos absorben luz ultravioleta siguiendo un patrón específico. Si la muestra es pura, al
no contener cantidades significativas de contaminantes como proteínas, péptidos, fenol o agarosa, la
medición espectrofotométrica de la radiación ultravioleta absorbida por las bases nitrogenadas es
sencillo y exacto. En el caso del ADN y el ARN, la muestra se expone a la luz ultravioleta a una
longitud de onda de 260 nanómetros (nm=1x10 °metros) y un fotodetector mide la luz que atraviesa
la muestra. Una parte de la luz ultravioleta pasará y otra será absorbida por el ADN/ARN. Cuanta
más luz absorba la muestra, mayor será la concentración de ácido nucleico en la misma. El efecto
resultante es que menos luz golpeará el fotodetector y esto producirá una mayor densidad óptica
(DO). En este método, los tampones acuosos con escasa concentración iónica (por ejemplo, el
tampón TE) resultan idóneos. La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a
260 m y comparando contra un blanco.

La interferencia de contaminantes en la absorbancia puede ser determinada calculando un

«cociente». Como las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular
la pureza de los ácidos nucleicos. Si esta relación es mayor a 1,6 puede estimarse que la muestra es
lo bastante pura para confiar en la cuantificación espectrofotométrica. Los cocientes respectivos del
ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. El cociente A260/A280 de las muestras
puras es de 2.2 aproximadamente. Sin embargo, una lectura de absorbancia de 230 nm que nos dé
una relación menor a 1,6, significa que la muestra está contaminada con hidratos de carbono,
péptidos, fenoles, compuestos aromáticos u otras sustancias (moléculas) que absorben a la misma
longitud de onda en la muestra y es recomendable una nueva re-extracción con fenol/cloroformo y
precipitación con etanol o isopropanol.

Fundamentos de la cuantificación del ADN por espectrofotometría.

El espectrofotómetro se basa en la transmisión de la luz a través de una solución para determinar la

concentración de un soluto presente en la misma. El aparato funciona de acuerdo a un sencillo
principio: se irradia una muestra con una radiación luminosa de longitud de onda conocida y se
cuantifica la energía luminosa transmitida con una célula fotoeléctrica situada detrás de la muestra.
Tal y como se muestra en la imagen 11.2, el espectrofotómetro de haz único consta de una fuente
luminosa, un prisma, una cubeta de cuarzo con la muestra a ser cuantificada y una célula
fotoeléctrica, Fig. 11.2.

Los distintos elementos están conectados a los sistemas eléctricos o mecánicos adecuados para
controlar la intensidad luminosa y la longitud de onda y para convertir en variaciones de tensión la
energía recibida en la célula fotoeléctrica. Las variaciones de tensión se miden en un contador o se
registran en un ordenador para su posterior análisis e interpretación.

Mediante la ley de Beer-Lambert es posible relacionar la cantidad de luz absorbida con la

concentración de la molécula absorbente por medio de la siguiente fórmula: [ADN] = E x A x b;
donde E es el coeficiente de extinción, que para el ADN es de 50ug/ml x cm], A es la absorbancia, la
cual se mide directamente en el espectrofotómetro y b es la longitud del paso óptico que por lo
general es de 1cm.
El coeficiente de extinción es un parámetro que define cuan fuerte una sustancia (molécula) absorbe
la luz a una longitud de onda determinada. El mismo dependerá de la composición y estructura de la
molécula y es utilizado para medir la concentración de una sustancia en solución cuando se usa la
ley de Beer-Lambert.

A una longitud de onda de 260 nm, el coeficiente de extinción medio para el ADN bicatenario es de
0,020 (ug/ml)-1 cm-1, para el ADN monocatenario es de 0,027 (ug/ml)-1 cm-1, para el ARN
monocatenario es de 0,025 (ig/ml)-1 cm-1 y para los oligonucleótidos monocatenarios cortos
depende de la lomgitud y la composición de las bases. Asi, una Absorbancia (A) de 1 corresponde a
una concentración de 50 pg/mi para el ADN bicatenario Este método de cálculo es válido hasta una
A de al menos 2. Es posible que se necesite un coeficiente de extinción más preciso para los
oligonucleótidos, éstos pueden predecirse utilizando el modelo del vecino más cercano