UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA

INFORME Nº 13:
Aislamiento de ADN bacteriano

ASIGNATURA:
Microbiología General
Práctica (martes y jueves 12 pm -2 pm)

DOCENTES:

- Gutierrez Moreno, Susana Mónica

- Sulca López, Marcos Alejandro

INTEGRANTES:
- Hugo Quispe, Jose Salvador Ernesto (22100128)
- Huamán Rondón, Sandra Mónica (22100121)
- Huaripata Huarcaya, Paloma Rebeca (22100132)
- Moreno Rosado, Mirella Dara (22100140)
- Quispe Quispe, Thasi (22100120)
- Tarazona Castillo Lissette (22100129)
- Tipiani Dueñas, Fiorella Francesca (22100139)
- Vega Delgado, Camila Jhanyna (22100046)

2023 - II
1. INTRODUCCIÓN

El aislamiento de ADN de microorganismos, especialmente de bacterias, se ha vuelto un

método esencial en casi toda investigación moderna en microbiología, por lo que su
entendimiento y adecuada aplicación es fundamental para cualquiera que quiera perseguir
una carrera como investigador (Wright et al. 2017). Este procedimiento tiene por objetivo
extraer la mayor cantidad de ADN en el mejor estado posible, para ello se siguen
generalmente los siguientes pasos: el cultivo y crecimiento de bacterias, la liberación del
ADN bacteriano, la inactivación de enzimas que degraden ADN, la precipitación del ADN y
la purificación del ADN.

Cabe mencionar que durante el procedimiento se debe preservar el ADN, por lo que se
utilizan agentes tamponantes (ejemplo: CTAB buffer) que mantienen el ADN a pH 7.5 - 8.5,
de forma que el ADN no se degrada ni se desestabiliza. Asimismo, hay que considerar otros
factores, entre ellos, la temperatura adecuada y agentes que inhiban la acción de las
ADNasas, por ejemplo la solución Tris-EDTA, donde el Tris mantiene el pH alcalino y el
EDTA actúa como agente quelante de los iones Mg 2+, necesarios para la acción de
ADNasas y ARNasas.

Para aislar el ADN bacteriano es necesario liberarlo de las células, por medio del
rompimiento de la pared celular y la membrana celular, esto puede realizarse mediante
métodos enzimáticos o mecánicos, como lo son el uso de lisozimas o el choque osmótico,
respectivamente. Una vez liberado el ADN es necesaria la purificación, que en realidad se
puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos, particularmente la cromatografía de
intercambio iónico, la cromatografía de gel de agarosa o la precipitación con etanol. Por
último, la pureza del ADN bacteriano se mide mediante la relación entre la absorción a 260
nm y la absorción a 280 nm, llamada “relación 260/280”, la cual debe ser superior a 1,8 para
indicar que el ADN está puro y libre de proteínas.
2. RESULTADOS

A. Aislamiento de ADN bacteriano

Figura 1. ADN aislado de Escherichia coli.

B. Determinación de ácidos nucleicos por absorción ultravioleta

Tabla 1. Lecturas de absorbancia obtenidas para medición de concentración.

Longitud de onda Absorbancia Concentración de ADN

230 0.024 ng/µ𝐿 1.20µ𝑔/𝑚𝐿

260 0.021 ng/µ𝐿 1.05µ𝑔/𝑚𝐿

280 0.032 ng/µ𝐿 1.60µ𝑔/𝑚𝐿

Se puede observar que en la Tabla 1 las lecturas de las absorbancias nos permiten hacer los
cálculos de las concentraciones que dan como resultado 1.20µ𝑔/𝑚𝐿 a 230 nm, 1.05µ𝑔/𝑚𝐿
a 260 nm y 1.60µ𝑔/𝑚𝐿 a 280 nm estas concentraciones se calcularon en una proporción de
1 en 50 µ𝑔/𝑚𝐿 por cada muestra.

Tabla 2. Determinación de pureza y criterios de validez por espectrofotometría.

Análisis Pureza Criterios de validez

A260/280 0.656 ADN contaminado

A260/230 0.875 ADN altamente

contaminado

En la Tabla 2, se observa el análisis de pureza de la muestra de ADN basada en la relación

de las absorbancias A260/280 y A260/230. De acuerdo con ello, para un valor A260/280
menor de 1.6 indica la presencia de ADN contaminado debido posiblemente por
 contaminación de compuestos aromáticos como fenoles y proteínas. Respecto a la relación
de A260/230 se observa que se obtuvo como criterio de validación ADN altamente
contaminado, esto debido a la presencia de sales, fenoles, hidratos de carbono, entre otros
contaminantes, además esto indica que cuanto menor sea este ratio la presencia de
contaminantes en la muestra será mayor para este caso se usó un ratio menor 1.5 que estaría
indicando una impureza relevante en la muestra que podría comprometer su funcionalidad.

3. DISCUSIÓN

En la actualidad existen múltiples métodos para la purificación de ADN, los cuales se

encuentran basados en diversos fundamentos como por ejemplo, papel FTA, columnas
sílicas, solventes orgánicos y otros. Lo curioso en los kits fabricados para la purificación de
ADN es que ciertos reactivos no presentan información específica respecto a la composición
de cada uno de ellos, esto sucede debido a que varios se encuentran patentados. Sin
embargo, ello no impide conocer la función y acción de cada uno y, por lo tanto, inferir los
agentes químicos que intervienen. Es importante tener en cuenta múltiples aspectos, como es
el caso de la cantidad de material genético a emplear, pues las grandes cantidades pueden
interferir en la calidad del ADN extraído, ello debido a que junto a este también se incluyen
proteínas asociadas, lípidos, polisacáridos y otras moléculas no deseadas (Mittmann et al.,
2007).

Los resultados obtenidos del aislamiento del ADN bacteriano no son óptimos para su uso en
otros experimentos que requieran de este tipo de muestras, ya que su pureza es menor a 1,6
en el análisis de A260/A280. Esto significa que el ADN aislado se encuentra contaminado
con proteínas, puesto que la absorbancia a 280 nm se utiliza para detectar la presencia de
estos compuestos. Por otro lado, se obtuvo un valor menor a 1.8 en el análisis de
A260/A230, lo que sugiere que existe una contaminación significativa con compuestos
absorbentes a 230 nm, como sales o solventes residuales.

Esta contaminación pudo haber sucedido por una posible co-precipitación de proteínas con
el ADN, una inadecuada eliminación de solventes y sales residuales durante el proceso de
extracción o por la presencia de inhibidores que afectan las mediciones. Debido a esto, es
importante tener en cuenta que, para mejorar la pureza del ADN, es necesario realizar
ajustes al protocolo de extracción, así como tener mayor cuidado al momento de manejar las
muestras y realizar el procedimiento.
4. CONCLUSIONES

● El procedimiento de aislamiento de ADN de bacterias sigue una serie de pasos clave,

desde el cultivo de bacterias hasta la purificación del ADN. Cada etapa tendrá un
propósito específico y contribuirá a la obtención de ADN en óptimas condiciones.
● La purificación del ADN bacteriano puede llevarse a cabo mediante varios métodos,
como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de gel de agarosa o la
precipitación con etanol. La elección del método depende de diversos factores, como
la pureza final requerida y el propósito de la investigación.
● La calidad del ADN aislado se evalúa mediante la relación de absorbancia 260/280,
que indica la cantidad de proteínas presentes. Una relación superior a 1,8 sugiere que
el ADN está puro y libre de contaminantes proteicos, lo cual es crucial para asegurar
resultados confiables en análisis posteriores.
● El ADN aislado de E. coli presentó, según los análisis en base a la relación de
longitud de A260/A280 y de A260/A230, una contaminación con compuestos
orgánicos aromáticos y sales.
● La inadecuada realización de los pasos para la extracción y purificación conllevo a la
inviabilidad del material genético.

5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Heikrujam, J., Kishor, R., & Behari Mazumder, P. (2020). The Chemistry Behind Plant
DNA Isolation Protocols. IntechOpen. doi: 10.5772/intechopen.92206

Mittmann F, Dienstbach S, Wagner G. Large scale extraction of high quality moss DNA.

Russian journal of plant physiology 2007; 54 (4): 564-568.

Programa de control de calidad de ácidos nucleicos (2020). Banco Nacional de ADN Carlos
III (Universidad de Salamanca).
https://www.bancoadn.org/docs/formulario-control-calidad-muestras.pdf

​Wright MH, Adelskov J, Greene AC. Bacterial DNA Extraction Using Individual Enzymes
and Phenol/Chloroform Separation. J Microbiol Biol Educ. 2017 Sep
1;18(2):18.2.48. doi: 10.1128/jmbe.v18i2.1348. PMID: 28861145; PMCID:
PMC5577976.