Facultad Medicina

Humana

LAB. BROMATOLOGÍA Y QUIMICA V

Danna Fiorella Asenjo Acuña1, Daniel Antonio Almonacid Guzman1, Gianella Pilar Burga
Hinostroza1, Fatima Lucia Belen Cajachagua Cueva1

1
Medicina Humana.

Informe de Práctica Nº2

ESPECTROFOTOMETRÍA

SPECTROPHOTOMETRY

Curso: Bioquímica

Profesor: María del Pilar Navarro

Hora de Práctica: 13:10 – 15:00

DIA: Miércoles

GRUPO: 3A2

1. INTRODUCCIÓN
El estudio bioquímico de las moléculas requiere el uso de técnicas analíticas que
permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como el hallazgo de sus
características físicas, químicas y biológicas.

Uno de los métodos más sencillos, accesibles y útiles es la espectrofotometría. El

cual consiste en un proceso que cuantifica la cantidad de una solución, valiéndose
de cuánta energía radiante es absorbida por las moléculas de la misma, en función
a la longitud de onda. (1)

La espectrofotometría se fundamenta en la capacidad de las moléculas para

absorber energía, entre ellas las radiaciones del espectro ultravioleta; esta
capacidad es conocida como la absorbancia y se relaciona con la tramitancia ya que
esta es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector del
espectrofotómetro una vez que ha atravesado la muestra y la cantidad de luz que
incide sobre ella. (2)

Los valores de absorbancia de una sustancia a diferentes longitudes de onda dan

lugar a una curva denominada espectro de absorción que es característico para
cada sustancia dependiendo de la estructura atómica y de las condiciones del medio
(pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica nos
(3)
permite determinar y caracterizar las biomoléculas.

Cuando la luz (energía) es absorbida por una molécula se origina un salto desde un
estado de energía básico a un estado de mayor energía (estado excitado). La
molécula solo absorberá la cantidad de energía que le permita pasar a su estado
excitado. Cada molécula absorbe diferentes cantidades de energía para llegar a su
estado excitado, eso les permite diferenciarse entre sí. Por ende la absorción que a
distintas longitudes de onda presenta una molécula constituye una señal de
identidad de la misma. (2)

2. OBJETIVOS:
 1. Aprender a manipular el espectrofotómetro
2. Conocer las aplicaciones del espectrofotómetro
3. Aplicación de la ley de Lambert-Beer
4. Determinación de la curva de calibración con solución de azul de metileno

3. MATERIALES Y MÉTODOS (Procedimiento experimental)

MATERIALES:

● Espectrofotómetro
● Reactivo de trabajo (analito)
● Cubeta
● Estándar o calibrador
● Blanco
● Inserto
● Azul de metileno
● Agua destilada
● Papel milimetrado
PROCEDIMIENTO DEL USO DEL ELECTROFOTOMETRO:

1. En primera instancia se debe conectar la fuente de potencia y posteriormente

encender el espectrofotómetro presionando el botón en la parte posterior.
2. En la parte delantera del espectrofotómetro se encontrarán botones los
cuales tienen funciones específicas, para esta práctica se presionará el tercer
botón de la parte superior el cual indicará que se debe introducir la longitud
de onda. Se debe tener en cuenta que esta varía dependiendo de qué luz se
esté utilizando, ya sea ultravioleta, el espectro visible o el infrarrojo.
3. A continuación se debe colocar una cubeta con el blanco en el lugar que está
representado por la letra B. El blanco es una sustancia que sirve para ajustar
el equipo a 0 de absorbancia y 100% de tramitancia.
4. Después de colocar el blanco en la letra B, se procederá a colocar el
estándar justo al lado. El estándar es una sustancia de concentración
conocida y sirve para determinar la concentración de un analito en particular
para comprobar si este es puro.
5. Como último paso se debe colocar el analito en los espacios vacíos; sin
embargo estos se encontrarán en cubetas ya sean de cuarzo (espectro
ultravioleta) o polietileno (espectro visible).

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTO 1:

1. En una cubeta de cuarzo se adiciona 4 mL de agua.

2. Posteriormente se adiciona 1 mL de solución de azul de metileno 1 mg/dL.
3. Se continúa mezclando dichas soluciones.
4. Luego de realizar la mezcla se debe crear tablas en las cuales estarán los
datos obtenidos a las diferentes longitudes de ondas.
5. A continuación se debe realizar una gráfica en el papel milimetrado, en dicha
gráfica el eje de las coordenadas significa la absorbancia (Eje Y) y el eje de
las abscisas las longitudes de onda (Eje X).
6. Finalmente se debe determinar el pico con máxima absorción en función de
las longitudes de onda.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTO 2:

1. Se debe identificar los tubos de ensayo los cuales tendrán diversos

componentes:
● 0.5 mL de azul de metileno 1 mg/dL + 4.5 mL de agua destilada
● 1 mL de azul de metileno 1 mg/dL + 4 mL de agua destilada
● 2 mL de azul de metileno 1 mg/dL + 3 mL de agua destilada
● 3 mL de azul de metileno 1 mg/dL + 2 mL de agua destilada
● 4 mL de azul de metileno 1 mg/dL + 1 mL de agua destilada
2. Se mezclan y se debe leer a 660 nm.
3. Este proceso sirve para poder realizar la curva de calibración en el papel
milimetrado.
 4. RESULTADOS

Procedimiento experimental (1)

La lectura de absorbancia que se obtuvo de la muestra con respecto a cada longitud

de onda fue la siguiente:

Longitud 560 580 600 620 640 660 680 700

de onda
(nm)

Lectura 0.2 0.30 0.4 0.5 0.7 0.9 0.6 0.30

(abs) 00 0 20 00 00 00 40 0

La siguiente imagen muestra la cantidad de luz absorbida por la muestra de azul de

metileno 1 mg/dL, según la longitud de onda. Pudiendo observar que el pico máximo
de absorción es 0.900 y se logra con una longitud de onda de 660 nm.
Procedimiento experimental (2)

Según las muestras de los 5 tubos de ensayos se procedió a hallar sus

concentraciones con el fin de graficarlos en la curva de calibración
Con estos datos se pudo formar la curva de calibración, la cual nos indica la
concentración de la sustancia (analito) de las muestras.

Con los datos de la curva de calibración se extrapoló para poder hallar un

aproximado de la absorbancia y junto a las concentraciones previamente halladas
para poder calcular el factor de calibración de cada uno y posteriormente un factor
de calibración promedio. (4)

5.
RECOMENDACIONES
Como bien sabemos, el espectrofotómetro es un equipo utilizado en el laboratorio
para el análisis de muestras fisiológicas por lo que una parte importante al momento
de usarlo es asegurarse de la limpieza del instrumento, ya que lo que menos se
desea es que por falta de higiene halla contaminación de las muestras. Además de
tener en cuenta una correcta manipulación por parte del usuario para no obtener
resultados alterados.

Por otro lado, al ser una maquinaria esencial en la cuantificación es imperativo

mantener los filtros y la fuente de luz (lámpara y condensador) en óptimas
condiciones ya que si un componente interno falla, la cuantificación se vería
comprometida.

(5)
Es por ello que se deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones:

a) Colocar el instrumento en un lugar en donde no esté sujeto a vibraciones, calor

excesivo, humedad o luz directa. (5)

b) Protegerlo del polvo. Nunca tocar las superficies ópticas tales como lentes y
filtros. Hay que seguir las instrucciones específicas de limpieza que viene en el
manual de instrucciones. (5)

c) Permitir que el instrumento se caliente antes de hacer algún procedimiento. (5)

d) Se debe hacer un chequeo periódico (cada semana) del ajuste de la longitud de

onda, cuando se sospeche que ha variado, con el Tubo de Didimium. (5)

e) Verifique el 0 y el 100% T cada vez que se vaya a hacer lecturas y cuando varíe
la longitud de onda. (5)

f) Asegurarse de que las cubetas estén limpias y libres de ralladuras y huellas

digitales. Esto debe hacerse cada vez que va a usarse. (5)

6. CONCLUSIONES
A través de los presentes experimento se pudo conocer que la absorbancia es la
capacidad que tienen algunas moléculas para embeber la radiación
electromagnética, gracias a esto se puede observar que dependiendo de la
concentración y la longitud de onda aplicada se puede obtener el punto máximo de
absorción, es decir que la longitud de onda y la absorbancia son proporcionales
hasta que la cantidad de solvente (agua destilada) varía, este puede disminuir o
aumentar la absorbancia. (2)
Por otro lado comprobamos que la ley de Lambert-Beer, explica que a determinada
longitud de onda la absorbancia de una muestra se ve influenciada por factores
tales como la distancia recorrida por la onda y la concentración de la solución.
Asimismo, se determinó que con la curva de calibración es posible hallar la
concentración de cualquier solución por medio de la absorbancia de esta y
(6)
aplicando la ecuación de la misma.

7. REFERENCIAS
1. Dorland. Diccionario médico de bolsillo. 23 a Edición. Madrid: Interamericana
McGraw-Hill; 1989.

2. Nieves A, Ruiz A, Fernández E, et al. Espectrofometría: Espectros de

absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas. 2017; 1-8.

3. Alfeo M. Manual de espectrofotometría en enología. 1ª Edición. Madrid: ISBN;

2010.

4. Harris Daniel C. “Análisis Químico Cuantitativo”, 2ª edición. Editorial Reverte,

España 2001.

5. Recomendaciones y cuidados de los espectofotómetros. Equipos y

laboratorios de Colombia. Colombia: PBX; 2019

6. Miller James N., Miller Jane C. “Estadística y Quimiometria para Química

Analítica”, 4ª edición, Editorial Prentice Hall, España 2002.

7. Barnar J, Chayen R. Métodos modernos de análisis químico, capítulo 3 (pág.

57, 62, 68, 69, 70, 75) España, 1970, ediciones urmo ATKINS P, Química
Física, capítulo 13 (pág 432 - 433) China, 2008, Editorial panamericana.

8. Douglas A. Química analítica, capítulo 23 (pág 614 - 620) 3ra edición, México,
2005, internacional Thompson editores S.A.