Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Biotecnología Ambiental

Práctica: Extracción de ADN Genómico

Elaboraron:
o Chávez Lozoya Samantha
o Chávez Morales Ana Karina
o Sánchez Meléndez Jesús Joaquín

Grupo: 4AV1

Profesores: Arellano Jocelyn Berenice // Moreno Zavala Fabiola

Fecha de entrega: 20/03/2018

Objetivos
 Realizar una extracción de material genético de una muestra de suelo.
 Analizar el ADN extraído utilizando técnicas de electroforesis y
espectrofotometría.
 Determinar la pureza del ADN obtenido.
Introducción
La extracción y análisis de ADN es una técnica de uso en distintas ramas de la
ciencia, entre ellas la ingeniería ambiental. Para conocer o identificar los
microorganismos presentes en un ecosistema o muestra ambiental es necesario
llevar a cabo la extracción y posterior análisis del ADN presente. En muchas
ocasiones esto se realiza para conocer si hay patógenos, conocer la diversidad
microbiana, identificar un microorganismo capaz de llevar a cabo algún tipo
de biorremediación, etc. En el caso del suelo, hay una gran variedad de
microorganismos presentes dependiendo del tipo de suelo. En general, en los
primeros 2 horizontes del suelo se espera un alto contenido de
microorganismos y materia orgánica o humus debido a la disponibilidad de
nutrientes, agua y oxígeno (Gerba, et al. 2009).
La extracción consiste en aislar y purificar las moléculas de ADN, basándose
en las características fisicoquímicas de estas (Alejos, et al. s.f). La molécula
de ADN se conforma por un grupo fosfato, una base nitrogenada y una azúcar
de 5 carbonos. El grupo fosfato le aporta un carácter negativo a la molécula, y
entre ellos tienen una fuerte tendencia a repelerse. Esto le permite al ADN
disolverse en soluciones acuosas, formándose una capa hidratante alrededor
del ADN. Esta capa se rompe cuando está en presencia de etanol, quedando
expuestos los grupos fosfato, y al agregarse una solución salina, el catión del
sodio se une al ADn y lo neutraliza, haciendo que precipite (Alejos, et al. s.f).
Existen distintos protocolos para obtener una cantidad y calidad de ADN
adecuados, y garantizar la eliminación de inhibidores potenciales. Los
métodos tradicionales utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas
del ADN, y poder aislar este mediante una precipitación en etanol. Para llevar
a cabo este procedimiento, se requieren preparar soluciones de distintas
naturalezas que serán utilizadas para extraer, romper, precipitar y conservar.
En general, consiste en cinco etapas principales: Homogeneización del tejido,
lisis celular, separación de proteínas y/o lípidos, precipitación, y redisolución
de ADN.
 1. Homogeneización del tejido
Consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la interacción
con las soluciones a utilizar. Puede ser una homogeneización mecánica (con
nitrógeno líquido o pistilos) u homogeneización química (detergentes,
proteasas y agentes caotrópicos para romper las uniones entre células e incluso
romper membrana celular).
2. Lisis celular
Se destruye o modifican las interacciones entre las moléculas que conforman
la pared, permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. En esta etapa se
utilizan soluciones básicas, detergentes, agentes caotrópicos para disolver la
membrana celular, e inhibidores de enzimas que puedan degradar el ADN.
3. Separación de proteínas y lípidos
Se separa el ADN de “contaminantes” que pueden ser proteínas y lípidos,
utilizando solventes orgánicos y tiempos de centrifugación. Esto se lleva a
cabo basándose en la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para
separarlos en medios acuosos, mientras que las proteínas y lípidos por su
propia naturaleza quedan disueltos en la fase orgánica.
4. Precipitación de ADN
Después del paso anterior, se recupera el ADN (en muchas ocasiones como
pastilla). Se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de Na + o
NH4+ que se unen a los grupos fosfato, permitiendo que el ADN se pliegue
sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Por lo regular, se utiliza un ciclo de
centrifugación con el fin de recuperar el ADN que queda en el fondo del tubo,
siendo posible decantar el etanol sobrenadante. Los restos de etanol se lavan
con etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporación.
5. Redisolución del ADN
Se hidrata el ADN para mantenerlo en solución, evitando una hidrólisis ácida
con un pH neutro y se almacena (Tris-HCl a 10 mM y EDTA a 0.1 M a pH 8).

Para cuantificar el material genético obtenido se determina el rendimiento

mediante espectrofotometría, utilizando como fundamento la Ley de Beer-
Lambert. El ADN absorbe la luz ultravioleta a 260 nm, y esto permite estimar
su concentración mediante espectrofotometría ya que cuando la longitud de la
celda en que se disuelve el ADN es de 1 cm, la absorbancia es igual a la
densidad óptica que es igual a 50 ug/ml. De no tener una celda de 1 cm, se
debe considerar el factor de dilución para obtener la concentración.
Con el fin de conocer la integridad del ADN se realiza una electroforesis en
gel de agarosa. Si este está íntegro, se debe observar una banda estrecha
cercana al pozo en que se colocó la muestra de ADN, de lo contrario se
observa un sendero luminoso a lo largo del carril de la muestra o una banda
ancha (Figura 1).

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa con un marcador de peso molecular (izquierda) y

muestras de ADN.

La muestra por analizar se obtuvo a una profundidad de 0-25 cm, del Bosque
de Chapultepec II Sección.
Metodología
[ORIGINAL]
Extracción con fenol para obtención de ADN de alta pureza

Precipitación con etanol

Lavados de pastilla
Electroforesis en gel agarosa
Estimación de concentración de ADN

[MODIFICADO]
Electroforesis en gel agarosa
Estimación de concentración de AD

Resultados
a) Espectrofotometría
Tabla 1: Resultados de Espectrofotometría

Espectrofotometría A260/A280 1.378

Cantidad de ácidos nucleicos 12.15%
Cantidad de proteínas 87.85%
Concentración 155 µg/ml

b) Electroforesis
No se alcanza a distinguir, pues el ADN se fragmentó
No poder leer la electroforesis se debe a:
-Bandas poco definidas
-Ausencia de bandas
- El ADN se ha degradado
- El ADN estaba contaminado con proteínas [Diaz,2018]
Figura 2. Imágenes analizadas con luz UV de electroforesis en gel de agarosa
#Nota: Las flechas horizontales señalan el marcador de peso molecular y las verticales la banda correspondiente a
la muestra analizada.

Análisis de resultados
Para (Alejos P. et al. 2007) al extraer ADN genómico y valorar su pureza con
espectrofotometría a la relación de longitudes de onda de 260/280 nm se
debería obtener un valor de entre 1.8 a 2.0 para suponer que es una muestra
pura de ADN, en el caso de esta evaluación se obtuvo una relación de 1.378 lo
cual señala según el mismo autor una presencia de proteínas o fenol en la
muestra. Una segunda valoración a 260/230 nm hubiese podido confirmar la
presencia de proteínas o de fenol en la muestra, debido a que no se realizó esta
podemos únicamente suponer que alguno de estos contaminantes son los que
se encontraban en la muestra. Por otro lado, Bravo, (2012) tabula la
concentración de ácidos nucleicos y proteínas en muestras de ADN según la
relación de la medición de espectrofotometría a 260/280 nm (Tabla 2), al
interpolar el valor obtenido encontramos que se tiene un 12.15% de ácidos
nucleicos en la muestra esto quiere decir que el 87.85% de nuestra muestra
valorada es de proteínas. El obtener un porcentaje tan bajo de ácidos nucleicos
se puede deber a fallos en el proceso de extracción, durante la discusión se
mencionó que era probable que el fenol estuviese contaminado y debido a esto
no se pudieron extraer el total de proteínas que hubiese permitido un ADN
más puro.
 Tabla 2: Relación de absorbancias y pureza de ADN tomada de [Bravo,2012]

En cuanto a la electroforesis en la muestra analizada obtuvimos una banda

borrosa y que corre por todo el gel de agarosa, Alejos P. (2007) menciona que
una banda que se corre a través de todo el gel de agarosa y se nota borroso
indica que el ADN de la muestra se degrado y por tanto se encuentra
fragmentado, debido a esto se crean cadenas de ADN con menor peso
molecular que son arrastradas por el gel de agarosa creando esa imagen
borrosa, además Diaz, (2018) señala que la presencia de proteínas en la
muestra también interfiere con la lectura de la electroforesis, este punto se
confirma con la alta presencia de proteínas que denota el análisis en
espectrofotometría. En la imagen analizada (figura 1) se nota una banda
horizontal señalada por las flechas rojas donde se aprecia que, efectivamente
existe ADN en la muestra, lamentablemente queda por debajo de la
comparativa con el marcador de pesos moleculares por lo que no se puede
mencionar el peso molecular que tendría esta muestra.
Uno de los factores por el cual la extracción no dio los resultados que se
esperaba fue la metodología.
Aquí se presentan algunas diferencias de ambas metodologías resaltando los
reactivos y su función.
Reactivos
Tabla 3. Comparación entre las metodologías.

Metodología Original Metodología modificada

300 -400 mg de suelo .2 mg de suelo
Buffer de extracción CTAB Agua miliQ
Fenol-Cloroformo Etanol frío
 Isopropanol frío
Solución de lavado 1
Solución de lavado 2

Tabla 4. Comparación entre los tratamientos de las muestras.

Metodología Original Metodología modificada
Incubación Microcentrifugación
Centrifugación Vortex

Es importante resaltar que nuestro suelo fue extraído del Bosque de

Chapultepec en la CDMX a una profundidad de 25 a 30 cm. La profundidad
de muestreo está determinada por el nutriente o propiedad del suelo que se
pretende cuantificar. Así, la materia orgánica y el pH se miden habitualmente
en capa superficial (0-20 cm) ya que es la profundidad donde ejercen mayor
influencia.[Ferrariz,2016] al ser una muestra de 25 a 30 cm se tiene una
cantidad menor a la de los primeros 20 cm al obtenerse una cantidad de
materia orgánica no quiere decir que sean microorganismos debido que la
cantidad de materia orgánica no está directamente relacionada con el ADN, la
materia orgánica en su mayor parte es humus y materia degradada es decir que
se necesita que la materia este viva para extraer el ADN.
El CTAB es un detergente catiónico que tiene la propiedad de precipitar
ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos en soluciones de baja concentración
iónica. Bajo estas condiciones las proteínas y los polisacáridos neutros
permanecen en solución. En soluciones de alta concentración iónica el CTAB
forma complejos con las proteínas y polisacáridos, pero no precipita ácidos
nucleicos. Por esta razón es especialmente útil para precipitar ADN genómico
de organismos que producen grandes cantidades de polisacáridos como las
plantas y algunas bacterias Gram negativas. [Muzquiz,2017] en nuestra
metodología no se usó este detergente y es un paso importante ya que el ADN
extraído fue el genómico y este detergente es un paso importante para la
extracción de ADN genómico.
Por otra parte, el fenol es un complemento usado para remover proteínas e
impurezas al momento de extraer el ADN de la célula por otro lado el
cloroformo se usa para eliminar proteínas y otros contaminantes celulares y
para obtener material genético más limpio que permita la separación de las
fases durante la centrifugación. [Alejos,2007] al no usar el fenol no podemos
asegurar que las proteínas fueran removidas.
El isopropanol que se ocupa en la metodología es para precipitar el ADN ya
que es insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol. [Bravo,2012] el
agregar etanol en vez de isopropanol el rendimiento es el mismo y el
funcionamiento es el mismo solo que el etanol al ser una solución más sencilla
se necesita en mayor concentración.
Por ultimo las soluciones de lavado 1 y 2 ambas soluciones contienen ETOH
al 76% y compuestos de acetato ,el etanol se usa para precipitar el ADN se
usa en concentraciones altas debido a que es soluble en este medio y se
necesita en una gran concentración para precipitar [Bravo ,2012] por otro lado
el acetato se usa para la separación del ADN plasmídico del ADN
cromosómico [Carbajal,2016] estas soluciones de lavando eran necesarias
para precipitar el ADN ya que no podemos definir que paso exactamente con
el ADN genómico al tener más de una variable que se manipulo mal estamos
recalcando las más importantes que se consideraron para dar una explicación
lógica y coherente de los factores que afectaron la extracción.
Conclusiones
Chávez Morales Ana Karina
La determinación de ADN genómico de un suelo extraído del bosque de
Chapultepec obtuvo un valorar de pureza con espectrofotometría a la relación
de longitudes de onda de 260/280 nm de 1.378 lo cual señala presencia de
proteínas.
Se tiene un 12.15% de ácidos nucleicos en la muestra esto quiere decir que el
87.85% de nuestra muestra valorada es de proteínas. El obtener un porcentaje
tan bajo de ácidos nucleicos se concluye que se debió a fallos en el proceso de
extracción, tales como contaminación por fenol, la falta de uso de un
detergente catiónico y la muestra de suelo analizada se tomó a una
profundidad de 25 a 30 cm donde la cantidad de materia orgánica se reduce y
al tener una reducción de materia orgánica la carga microbiana se reduce. La
cantidad de ADN se obtiene de los microorganismos vivos y debido a que en
la materia orgánica no solo se encuentran organismos vivos también se
encuentran humus y materias que ya se degradó, la cantidad de ADN extraído
es mínima.
Chávez Lozoya Samantha
Se extrajo material genético de una muestra de suelo del Bosque de
Chapultepec, y posteriormente se pudo analizar la calidad de ADN. Mediante
la electroforesis en gel de agarosa realizada no fue posible determinar la
cantidad de pares de bases presentes en la muestra.
La relación A260/280 fue de 1.378, indicando una contaminación,
posiblemente por proteínas, lo cual da indicios de una pobre separación de
proteínas y lípidos durante el procedimiento. Esta relación está ligada al
resultado de la electroforesis en gel.
Sánchez Meléndez Jesús Joaquín
Se obtuvo una relación de absorbancias a 260/280 nm de 1.378 lo que indica
contaminación por proteínas. En la electroforesis la muestra de ADN estaba
presuntamente degradada, según se miraba el corrimiento en el gel, por lo que
no fue posible leer el peso molecular con el marcador de PM.

Memoria de Calculo

ug μg 50( factor de dilución)

Concentración de ADN [ ]
ul
=50
ml
x DO 260 x
1000

μg
50 ∗0.062∗50
mL ug ug
Concentración de ADN= =0.155 =155
1000 uL mL
µg
Concentración de ADN=155
mL

Bibliografía
Bravo, González. (2012) Manual de prácticas de laboratorio de biología
molecular 10/03/18 de UAM Sitio web:
laboratiodebiologiamolecular.PDF
Alejos L. P., Aragón, M. del C., Cornejo, A. (2007) Extracción y
purificación de ADN 10/03/18 de INECC Sitio web:
www.publicaciones.ineec.gob.mx
Carbajal A. (2016) Extracción y purificación del DNA 10/03/19 de
LABOME Sitio web: www.labome.es
Luque J. (2007) Biología molecular e ingeniería genética. Madrid España:
Elsevier
Salazar, Sandoval. (2013) Biología Molecular. México: Mc Graw Hill.