PRÁCTICA 8. Cuantificación de ácidos nucleicos por espectrofotometría.

E QFB Janeth Rodríguez López 190029

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Instituto de Ciencias Biomédicas, Departamento de
Ciencias Químico-Biológicas, Laboratorio de Biología Molecular, Grupo B-L1

Palabras clave: ADN, ARN, espectrofotometría, absorbancia, celda de cuarzo.

Introducción. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, reciben su nombre porque son moléculas con propiedades
ácidas (por ejemplo, carga negativa en soluciones acuosas) y se encontraban originalmente en el núcleo celular,
aunque hoy se sabe que también se encuentran en la mitocondria. Para ser estudiados, los ácidos nucleicos
deben separarse de otros componentes celulares, como los lípidos y las proteínas, que son más abundantes
que los ácidos nucleicos. De igual forma, dependiendo del objeto de investigación, se debe aislar
preferentemente el ADN o el ARN; así, el ARN se extrae para estudiar los niveles de expresión génica, mientras
que el ADN se utiliza para buscar modificaciones o cambios genéticos (Salazar Montes, Sandoval Rodríguez &
Armendáriz Borunda, 2013).

Existen diferentes métodos para cuantificar los ácidos nucleicos; los más utilizados son la espectrofotometría y
la fluorometría (Salazar Montes, Sandoval Rodríguez & Armendáriz Borunda, 2013).

Espectrofotometría

La base de la espectrofotometría es que cualquier solución que contiene moléculas en suspensión permite que
un haz de luz la atraviese en proporción inversa al número de moléculas que contiene. Los nucleótidos de ADN
y ARN muestran una absorción máxima a 260 nm (luz ultravioleta, UV); por lo tanto, los espectrofotómetros son
el dispositivo más utilizado para determinar la concentración de ácidos nucleicos en solución. En la celda del
espectrofotómetro, un haz de luz atraviesa la solución de ácido nucleico y, después de atravesar la muestra, un
fotodetector mide la intensidad de la luz absorbida. Cuanta más luz absorbe la muestra (absorbancia), mayor
es la concentración de ácidos nucleicos. Los conceptos básicos para medir la concentración molecular con un
espectrofotómetro se muestran en la figura 1 (Salazar Montes, Sandoval Rodríguez & Armendáriz Borunda,
2013).

Figura 1. Conceptos básicos para medir la concentración molecular con un espectrofotómetro,

Funcionamiento del espectrofotométrico.

La luz UV o visible es emitida por una lámpara que dirige los rayos a través del condensador hacia la muestra,
que se encuentra dentro de la celda de cuarzo (un material que no impide la absorción de la muestra). La luz
se absorbe en proporción a la concentración de la muestra. El detector mide la luz no absorbida por la muestra
restándola de la luz emitida original, dando una lectura en unidades de absorbancia entre 0,001 y 1,000 (Salazar
Montes, Sandoval Rodríguez & Armendáriz Borunda, 2013).

Metodología

Se utilizarán las muestras de ADN cromosomal, ADN

plasmídico y ARN total de experimentos pasados.

Colocar 69 μL de H2O con una micropipeta y

transferirlos a una celdilla.

La celdilla con H2O se pondrá en el

espectrofotómetro y se ajustará la lectura a 0.0, por
lo cual se le picará al botón de dsDNA a 260 nm.

Luego se agarra 1 μL de muestra, al momento de Se repetirá de nuevo cada paso, para cada muestra
tomar la muestra se resuspenderá ahí mismo y diferente. Limpiar con agua destilada cada que se
también al momento de colocar en la celdilla con cambie de muestra.
agua y se leerá la absorbancia.

Resultados y discusión.
Cada muestra obtuvo diferentes absorbancias y se pueden ver a continuación:

ADN cromosomal ADN plasmídico ARN total

Figura 2. Absorbancias de cada muestra.

Mediante espectrofotometría se puede determinar la concentración y la pureza de una muestra de ADN y ARN
basándose en la capacidad de absorbancia de un compuesto presente en una solución a una longitud de onda
determinada. Así, la concentración de la muestra de ADN y ARN se calcula teniendo en cuenta el valor de
absorbancia obtenido en longitud de onda a 260 nm (Cuantificación de ácidos nucleicos mediante diferentes
técnicas, 2023).

La relación de absorción A260/280 se utiliza para evaluar la pureza de las muestras.

La relación A260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima tiene un valor entre 1.8-2.0.
Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relación A260/280 > 1.6. Un valor A260/280 < 1.6 indica
una posible contaminación por compuestos aromáticos como fenoles y proteínas. Un radio A260/280 > 2.1
podría deberse a la presencia de ARN en la muestra (Cuantificación de ácidos nucleicos mediante diferentes
técnicas, 2023).

En el caso del ARN la relación de absorbancias A260/280 con un valor entre 2.0-2.2 se considera indicativa de
un ARN de pureza óptima. Valores A260/280 > 1.7 se corresponden a una muestra de ARN con una pureza
aceptable. Un ratio A260/280 < 1.7 seria indicativo de contaminación por la presencia de compuestos aromáticos
(Cuantificación de ácidos nucleicos mediante diferentes técnicas, 2023).

Toda esta información es importante ya que no ayuda a saber el grado de pureza que tiene cada muestra, en
la figura 2 vemos que la absorbancia del ADN cromosomal según los valores se considera que tiene un valor
del 0 μg/μL, lo cual nos indica que esta muestra está contaminada por compuestos como seria el fenol o
proteínas, en la siguiente imagen tenemos al ADN plasmático el cual nos dio un valor de 6.3 μg/μL, nos indicaría
que podría contener ARN en esta muestra. Y por último tenemos el ARN el cual nos dio una absorbancia de 7.3
μg/μL el cual es una muestra con una pureza aceptable.

Conclusión. Gracias a esta práctica fue posible determinar la concentración de ADN y ARN de las muestras
que se estudiaron utilizando el fundamento de la espectrofotometría para conocer su absorbancia a 260 nm.
Debido a las observaciones, particularmente cualquier modificación hasta las más pequeñas de los pasos de
este procedimiento de extracción es importante ya que necesitamos saber el valor de la pureza que está
presente en la molécula. El cuidado con que el ADN y ARN es importante para fines de aprendizaje. Se realizó
la cuantificación de ADN y ARN por espectrofotometría, para la cual, dicha practica resulto satisfactoria en
tiempo y forma.

Bibliografías
1. Salazar Montes A., Sandoval Rodríguez A, & Armendáriz Borunda J. (Eds.). (2013). Extracción de ácidos
nucleicos. (pp 104-105). Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud.
McGraw Hill.
2. Cuantificación de ácidos nucleicos mediante diferentes técnicas. (1 de abril del 2023). Vall d´Hebron
Institut de Recerca. Obtenido de: https://vhir.vallhebron.com/sites/default/files/2022-06/UAT-
quantificacio-fluorometrica-acids-nucleics.pdf