PRÁCTICA No.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS

1. OBJETIVOS.

1.1. Conocer los principales métodos de valoración de las proteínas.

1.2. Recordar las leyes básicas de absorción de luz para la determinación cuantitativa de
compuestos coloreados.
1.3. Definir los componentes de un espectrofotómetro que permita comprender el manejo
del mismo.
1.4. Construir una recta de calibración con una solución de albúmina de suero bovino
como proteína patrón para cada una de los métodos colorimétricos del Biuret y de
Lowry.
1.5. Establecer el desarrollo de los métodos determinando la linealidad, la sensibilidad, el
límite de detección y el rango de cada uno de los métodos ensayados.
1.6. Determinar el contenido de proteína en muestras problema por el método de Biuret y
el método de Lowry

2. PRELABORATORIO
3. Indique otras técnicas analíticas diferentes a UV-Vis que permitan reconocer y
cuantificar proteínas en una muestra.

Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los
siguientes:
MÉTODO DEL BIURET
En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando un
color purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se
utiliza una solución de albúmina. Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura)
MÉTODO DE LOWRY
Dependen de la concentración de tirosina y triptófano de la muestra. Consiste en dos
reacciones:
TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA
Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión parte de la luz
se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersión de la luz
depende de: la longitud de onda de la luz , del tamaño de la partícula y del índice de
refracción de la partícula en relación con el medio que la rodea.
La dispersión de la luz se puede medir por turbidimetría o por nefelometría.
En ambas técnicas, para dar como resultado una concentración de proteína concreta, se
compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersión con los valores
de dichos parámetros en estándares proteicos conocidos.
La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través e una suspensión de
partículas utilizando para ello unespectrofotómetro (detector en la misma dirección del haz
de luz, semide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para quehaya una
buena disminución de la luz transmitida) ej. determinaciónde proteínas totales en suero,
LCR u orina (haciendo que lasproteínas precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico).
La nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida
(generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90º). Utiliza como instrumento el
nefelómetro (en el que el detector se ubica con un ángulo que oscila entre 15 y 90º ej. a
90º). Se suele utilizar para concentraciones más diluidas.
INMUNODIFUSIÓN
La inmunodifusión se basa en la formación de bandas de precipitación Ag-Ac en medios
semisólidos (generalmente de agarosa).La formación de inmunocomplejos se ve afectada
por variables como: pH,temperatura, fuerza iónica del medio, características propias del
Ac como afinidad y avidez y, la más importante, la concentración relativa de Ag y Ac.
La zona óptima de concentración para la formación del precipitado Ag-Ac se llama
zona de equivalencia.
La inmunodifusión se puede clasificar atendiendo a distintos criterios. Entre otras
modalidades podemos hablar de:
a) Inmunodifusión radial: en este caso se añade un antisuero específico a la
agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan
en ellos estándares de proteínas y problemas (antígenos). El antígeno difunde en el
gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. Em la zona de equivalencia se
produce un anillo de precipitación
a) Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony: se forman pozos en el gel de
agarosa, generalmente en patrón de roseta. Se depositan antisueros específicos en
los pozos centrales y los estándares de proteínas y los problemas en los pozos
circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el anticuerpo y el antígeno
alcanzan la equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posición y
forma de la banda de determinan según la concentración del antígeno y del
anticuerpo, y sus tamaños. La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es
directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente.
ELECTROFORESIS
Una de las técnicas más sencillas para la separación (y posterior cuantificación) de
proteínas es la electroforesis (técnica en la cual una partícula cargada se hace
desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico). Cuando se aplica un
campo eléctrico a un medio que contiene partículas cargadas, las partículas cargadas
negativamente migran hacia el ánodo o polo positivo mientras que, las cargadas
positivamente migran hacia el electrodo negativo (cátodo). Este principio se puede
aplicar para separar las fracciones de proteínas puesto que los aminoácidos (aa)
constituyentes de la proteínas, y por tanto las proteínas, son compuestos anfóteros
que se comportan como ácidos (ceden protones y quedan con carga negativa) o
bases (captan protones y quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el
que estén.
INMUNOELECTROFORESIS
La inmunoelectroforesis es una inmunodifusión en la que se aplica una corriente
eléctrica para separar las proteínas de la muestra.
Esta técnica se realiza en dos fases:
• Electroforesis para separar las proteínas de la muestra en función de su carga.
• Aplicación de un antisuero, mono o poliespecífico, en un surco paralelo a la dirección
del campo eléctrico. El o los anticuerpos difunden durante 18-24h. Si se produce el
reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitación.
Se utiliza fundamentalmente para analizar, cualitativamente, alteraciones
de distintas proteínas, especialmente inmunoglobulinas en suero, orina o líquido
cefalorraquídeo.
INMUNOELECTROFORESIS EN COHETE
La inmunoelectroforesis en cohete es una técnica cuantitativa equivalente a la
inmunodifusión radial pero, a en la que la placa se expone a un campo eléctrico.
Al igual que en la inmunodifusión radial, el antisuero (Ac) se incorpora al gel de manera
que el Ac no pueda migrar. En el gel se realizan unos pocillos (generalmente en el cátodo)
que se rellenarán con la muestra o con diluciones patrón. Una vez depositadas éstas se
activa el campo eléctrico. El Ag se desplaza en la agarosa y precipita al encontrarse con
el Ac. La precipitación va produciéndose a medida que el Ag avanza hacia el ánodo de
manera que al ir disminuyendo la concentración de Ag los bordes laterales se van
acercando hasta unirse. Así, se produce una precipitación triangular (en estela de cohete).
La concentración de Ag de la muestra es directamente proporcional al área y altura del
triángulo. Comparando lo resultados de la muestra con los obtenidos en las diluciones
patrón obtendremos un resultado cuantitativo.
INMUNOFIJACIÓN
La inmunofijación consiste en la separación electroforética de las proteínas de una
muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de celulosa impregnada con
antisuero. La unión Ag-Ac da lugar a la formación de bandas de precipitación visulalizadas
tras lavar y teñir. Es una técnica muy rápida que se utiliza especialmente en le detección
de bandas oligoclonales en líquido cefalorraquídeo.

4. Definir los componentes de un espectrofotómetro que permita

comprender el manejo del mismo. Haga un esquema del mismo.

El espectrofotómetro es un instrumento con el que se apoya la espectrofotometría

para medir la cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de
una solución muestra. instrumento utilizado para comparar en función de la longitud de
onda la magnitud la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene
una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la
misma sustancia.

5. ¿Con base en la guía y lo investigado, que prueba es más sensible para

reconocer proteínas, método colorimétrico de Biuret o método
colorimétrico de Lowry?

La prueba que es más sensible para reconocer proteínas es el método de lowry

por que su rango empieza desde de 0.1 a 1mg x ml y es mucho más cercano
para la cuantificación de proteínas .
 6. ¿Por qué es importante conocer que el máximo de absorción en la región
visible del espectro sea para el método de Biuret de 540 nm y para el
método de Lowry de 650 nm?

Es importante porque la longitud de onda es un valor que se da en nanómetros que

es característico de cada sustancia y me indica que a ese valor todos los fotones pasan
atreves de la muestra ,siempre van en un rango de longitud de onda característico donde
solo hay un valor máximo de absorción donde no se pierde ningún fotón, es decir si no
se pierden fotones mi respuesta es la máxima por que se contabilizaron mucho más
fotones en esa longitud de onda.
 - DIAGRAMAS DE FLUJO
Determinación del contenido de proteína (albumina) por el método de
Biuret
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE PROTEÍNA (ALBUMINA) POR EL
MÉTODO DE LOWRY
 INTRODUCCIÓN

  Existen diversos métodos que permiten cuantificar la concentración de proteína presente

en las muestras biológicas, basados en las propiedades que muestran las proteínas en
solución.
Los métodos más usuales son:
- Reacción del Biuret.
- Método de Lowry.
- Método de Bradford.
- Método del ácido Bicincónico.
- Absorción en el ultravioleta.
- Métodos inmunológicos.

Nota: Para ampliar la información ver archivo anexo.

En la práctica se van a ensayar los dos primeros métodos colorimétricos de Biuret y

Lowry. 

2.1. Fundamento del método de Biuret

Como se vio en la práctica anterior, el nombre de la reacción del Biuret procede del
compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con
eliminación de amoníaco.
 
H2 N CO NH2 Q
H2 N CO NH CO NH2
H2 N CO NH2
Urea Biuret
Reacción del Biuret
 

Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO 4) se añade a una

solución de proteína se forma un complejo entre el ion cúprico y los enlaces
peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo
de absorción a 540 nm. Los compuestos con enlaces peptídicos producen un cambio
de color del azul al púrpura cuando reaccionan con Cu (II) en medio alcalino. El
compuesto más sencillo que da la reacción es el biuret. El ensayo es bastante
específico para proteínas, pero poco sensible, requiriendo de 1 a 10 mg de proteína.
El reactivo de biuret no contienen urea.

Las características más importantes de la reacción son:

A. La reacción del Biuret se aplica y es positiva a partir de tetrapéptidos, y proteínas.

B. Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/mL.
C. No depende de la composición de aminoácidos.
D. De acuerdo a la práctica anterior, se sabe que algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.)
dan la reacción.
 
 O C C O
NH HN
RC H H CR
Cu2+
O C C O
NH HN
RCH H CR

Violeta-púrpura
Complejo proteína-Cu(II)

2.2. Fundamento del método de Lowry

Para aumentar la sensibilidad en el orden de 0,1-1 mg/mL respecto de la reacción del

biuret, el complejo proteína-Cu2+ se hace reaccionar con el reactivo denominado de
Folin-Ciocalteuau, dando una coloración azul, con un máximo de absorción a 650 nm.
Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a
azul de heteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos
tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que
forman el complejo con el Cu2+.
 
Las características del método son:
La intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos de la proteína.
Es más sensible que el ensayo de biuret. El rango es de 0,1-1 mg/mL
Presenta muchas interferencias.

Complejo Complejo
2+ 2+
Proteína-Cu Proteína-Cu
AA red. AA oxid.

Reactivo Folin Reactivo Folin

reducido.
oxidado.
AMARILLO AZUL

Esquema de la reacción de Lowry

2.3. Fundamento del método de Bradford

Consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los

residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante azul Coomassie.
Absorbe luz a 595 nm.
 El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4
mg/ml (ensayo estándar).
La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y
aromáticos.

2.4. Fundamento del método del ácido Bicincónico.

Está basado en la reducción en medio alcalino de Cu (II) a Cu (I) en medio alcalino y

la formación de un complejo ácido bicincónico: Cu (I), con un máximo de absorbancia
a 562 nm.
El rango de concentración de proteína es de 0,5-30 mg/ml.
Más rápido que el método de Lowry.
Altamente preciso y sensible.

2.5. Fundamento del método de Absorción en el ultravioleta:

  Las proteínas poseen una banda de absorción a 280 nm como consecuencia de la

absorción de los residuos de tirosilo y triptofanilo en esta región del espectro.
Es un método no destructivo.
El rango de concentración que se puede determinar depende del contenido de los
aminoácidos Tir y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml.

La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.

2.6. Protocolo a utilizar para determinar la concentración de proteína de una

muestra desconocida

Una vez obtenida la recta de calibrado, si se deseara conocer la concentración de

proteína de una muestra problema, se debe seguir el mismo procedimiento para
cada uno de los métodos, pero tomando 2 mL de la muestra problema en el caso del
método del Biuret, ó 1 mL para el método de Lowry y se mide la absorbancia.

Si la absorbancia de la muestra está dentro del rango de medida del método

seleccionado, mediante la ecuación de la recta de calibrado se puede calcular la
concentración de proteína de la disolución problema.
Si la absorbancia es mayor al límite superior del rango de medida, siempre se puede
realizar la dilución correspondiente para introducirla en el rango del método. Pero si
es inferior al límite de cuantificación del método seleccionado, hay que emplear un
método más sensible.

3. PRELABORATORIO

a. Indique otras técnicas analíticas diferentes a UV-Vis que permitan reconocer y

cuantificar proteínas en una muestra.

b. Definir los componentes de un espectrofotómetro que permita comprender el

manejo del mismo. Haga un esquema del mismo.
 c. ¿Con base en la guía y lo investigado, que prueba es más sensible para reconocer
proteínas, método colorimétrico de Biuret o método colorimétrico de Lowry?
El método de Lowry es más efectivo que el método colorimétrico de Biuret

d. ¿Por qué es importante conocer que el máximo de absorción en la región visible

del espectro sea para el método de Biuret de 540 nm y para el método de Lowry
de 650 nm?

4. MATERIALES Y REACTIVOS

20 tubos de ensayo, gradilla, pipetas de 1 y 5 mL., estufa, 1 probeta de 10 y de 5 mL.,

espátula, 2 baños de agua calefactor, 5 pinzas para tubos de ensayo, jeringa
desechable.

Disolución de albúmina (5 ó 10 mg/mL), tampón fosfato pH 7, 10 mM, reactivo de Biuret,

reactivos A, B y C de Lowry, suero sanguíneo (5 ml por grupo) para obtener disolución
de proteínas problema (plasma diluido en agua destilada 1:20)

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.1. Extracción de la ovoalbúmina.

De una clara de huevo de gallina, tome entre 1-2 g con la ayuda de una espátula o
una pipeta Pasteur. De esa cantidad, el 10% aprox. es ovoalbúmina, la proteína más
abundante en la clara. Diluya 20 veces con tampón fosfato (añadiendo 19 a 38 ml de
tampón según el peso de clara obtenido). Agite hasta obtener una disolución
homogénea. En caso de que existan flóculos, elimínelos mediante centrifugación a
4000 rpm durante 5 min.

5.2. Determinación del contenido de proteína (albumina) por el método de Biuret

A partir de la disolución de albumina de suero bovino patrón y de acuerdo al protocolo

presentado en el archivo soporte, determine la absorbancia para los 8 primeros
tubos que aparecen en el siguiente cuadro.

Tome 2 mL de disolución de concentración desconocida de albúmina de clara de

huevo y determine la absorbancia (Densidad óptica, correspondiente al tubo 9).

Albúm Absorbanci
Disolución de
ina (5 o a de los Reactiv
Concentració concentració Concentració Agu
Tub 10 tubos o de
n de curva n n de solución a
o mg/mL) patrón y Biuret
patrón desconocida desconocida (mL)
Vol. sustancia (mL)
(mL)
(mL) problema
1 0 0 - 0 - 2 3
 2 0,2 1 - 0,2 - 1,8 3
3 0,4 2 - 0,37 - 1,6 3
4 0,6 3 - 0,56 - 1,4 3
5 0,8 4 - 0,75 - 1,2 3
6 1 5 - 0,9 - 1 3
7 1,2 6 - 0,98 - 0,8 3
8 1,4 7 - 1,05 - 0,6 3
9 -   2 0,6 3,49 - 3

Si no da color violeta a temperatura ambiente, introduzca el tubo en el baño de agua

termostatizado a 37 ºC, dejando que se desarrolle el color durante 15 min. Recuerde
que para todos los tubos se debe medir absorbancia a 540 nm.

Represente gráficamente las absorbancias frente a las concentraciones. Obtenga la

recta patrón y deduzca la concentración de proteínas (mg/mL) de la disolución
problema.

Gráfica 1. Curva patrón BSA, método de Biuret.

5.3. Determinación del contenido de proteína (albumina) por el método de Lowry

Prepare 5 mL de otra disolución de albúmina de clara de huevo problema a partir de la

disolución desconocida anterior. Para eso, tome 0,2 mL de esa solución y adicione 4,8
 mL de agua destilada. De esa solución tome 1 mL que será la disolución de
concentración desconocida y complemente el protocolo dado para construir una recta
patrón.

Concentra
Absorba
BSA ción de la Disolución Ag Reacti Reacti Reacti
ncia de
0,2 Curva de ua vo vo vo
los tubos
Tub patrón y concentra
patrón y
os de la ción
sustanci
mg/ solución desconoci (m A B C
a
mL desconoci da L) (mL) (mL) (mL)
problema
da
1 0 0 - 1 0,9 0,1 3 0
2 0,1 1 - 0,9 0,9 0,1 3 0,033
3 0,2 2 - 0,8 0,9 0,1 3 0,061
4 0,3 3 - 0,7 0,9 0,1 3 0,088
5 0,5 4 - 0,5 0,9 0,1 3 0,136
6 0,7 5 - 0,3 0,9 0,1 3 0,166
7 0,9 6 - 0,1 0,9 0,1 3 0,185
8 - 1,6 1 - 0,9 0,1 3 0,05

Vea las instrucciones dadas para la curva de calibración en cuanto a temperaturas.

Mida absorbancia a 650 nm. Represente gráficamente las absorbancias frente a las
concentraciones. Obtenga la recta patrón y deduzca la concentración de proteínas
(mg/mL) de la disolución problema.

Gráfica 2. Curva patrón BSA, método de Lowry.

 a. ¿Como puede relacionar la concentración de la solución desconocida o problema
con la curva patrón para cualquiera de los dos métodos?

Mediante la interpolación de estos valores en la curva patrón. Para ello, se efectúan

disoluciones de muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el
consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas,
después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la
sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración
de ésta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y,
empleando la curva patrón, se puede interpolar el dato de la muestra problema
hasta encontrar la concentración (Harris, 2001).

b. ¿Qué absorbancia esperaría Ud. obtener al analizar soluciones desconocida de 0,09

y 0,8 mg/mL? ¿Qué método emplearía para determinar sus concentraciones

Para predecir la absorbancia de la solución desconocida utilizamos la función

tendencia de Excel, utilizando el método de Biuret y relacionando la absorbancia de
las demás soluciones con sus concentraciones obtenemos una curva patrón en la
que interpolamos los datos obtenidos del cálculo de las absorbancias y
concentración de las soluciones desconocidas.

Gráfica 3. Curva patrón, interpolación solución desconocida, método de Biuret.

Del mismo modo realizamos los cálculos correspondientes, utilizando el método de

Lowry.
 Gráfica 4. Curva patrón, interpolación solución desconocida, método de Lowry

c. ¿En que se basa Ud. para predecir los resultados anteriores?

En el supuesto de que, a mayor concentración de proteína, mayor es la densidad
óptica de la solución, hecho que se ve reflejado y representado en las gráficas
anteriores, donde a mayor concentración de proteína, mayor fue su absorbancia.

6. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

Harris, D.C. (2001). Análisis químico cuantitativo. 2a ed. Reverté, México.

Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioquímica. 2ª ed. Reverté, Barcelona.

Grupo de trabajo N°.2

Integrantes:
Doris Adriana Paipa Vargas 201820576
Cesar David Torres Bedoya 201820401
Diego Alejandro Arévalo Manrique 201820380

Fecha de práctica: 27/08/2020

Fecha de entrega de informe: 03/09/2020
Enlaces:
https://www.youtube.com/watch?v=jTS8TRuZXWI
https://www.youtube.com/watch?v=eVmFrf4T93A
https://www.youtube.com/watch?v=iNmmkZXgbf0
https://www.youtube.com/watch?v=hdb3s4YHkms
https://www.youtube.com/watch?v=ZA1lzPMyCMU
https://www.youtube.com/watch?v=SAY7THWad9o