ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA Y

CUANTIFICACIÓN DE ADN
Patrick A. Bent Bowie - patricka.bentb@utadeo.edu.co
METODOLOGÍA

Figura 1. Procedimiento para la electroforesis en gel de agarosa.

Figura 2. Procedimiento para la cuantificación de ADN por Nanodrop 1000.

FICHAS TÉCNICAS
Tabla 1. Ficha de seguridad para el EDTA (ácido etilendiaminotetraacético).
Tabla 2. Ficha de seguridad para el Buffer TBE.

Tabla 3. Ficha de seguridad para el azul de bromofenol.

CUESTIONARIO
1. ¿Qué otra técnica de cuantificación existe para determinar la concentración de
ADN? Explique el principio de la cuantificación.
RESPUESTA: Existen diversas técnicas de cuantificación de ADN y estas pueden ser
agrupadas de acuerdo al principio bajo el cual se basan, de acuerdo a esto tenemos:
● MÉTODOS BASADOS EN ABSORBANCIA
El empleo de absorbancia de rayos UV es una de las formas más comunes de
cuantificación de ADN. El método implica la medición de la absorbancia o
transmisión de luz a través de un líquido. Todas las moléculas absorben en
diferentes longitudes de onda de luz en diferentes grados y además, muchas
moléculas tienen una longitud de onda específica en la cual absorben al máximo.
Gracias al espectrofotómetro podemos medir estas absorbancias empleando
cubetas transparentes a los rayos ultravioleta. Primero, mide la absorbancia del
tampón en el que se encuentra el ADN el cual es un "blanco" y mide la absorbancia
de fondo. Luego mides la absorbancia de la muestra de ADN. Estas medidas de
absorbancia le dan una idea de la concentración de su preparación de ADN y si hay
otros contaminantes (G.T.B.&.Co.Kg, 2021).
○ Espectrofotometría UV usando absorbancia a 260 nm; esta técnica tiene
como principio el hecho de que la absorbancia ha sido el método de elección
 para la cuantificación de ácidos nucleicos desde hace décadas. Los pros de
este método están en su simpleza y conveniencia, puesto a que no es
necesario ningún tipo de tratamientos especiales a la muestra (a parte de la
extracción). Por otro lado, el gran inconveniente de esta técnica está en que
no es muy específica (mide todos los ácidos nucleicos en su conjunto) y
además es muy sensible a los contaminantes, por lo que requiere un ADN
muy puro para ser preciso (Tsang, 2020).
○ El método de la difenilamina (prueba de Dische); este método de
cuantificación del ADN por absorbancia tiene sus bases en la reacción de la
difenilamina con el azúcar de la desoxirribosa la cual forma un complejo azul.
Los inconvenientes radican en el tiempo necesario, y la insensibilidad de esta
técnica, razones por las cuales ya no es tan empleada en los laboratorios. En
cuanto a sus mayores pros, tenemos que la medición se realiza en el rango
visible y además se puede realizar a 595 nm con un lector estándar (Tsang,
2020).
● MÉTODOS BASADOS EN LA FLUORESCENCIA
Mediante el uso de tintes fluorescentes es posible una cuantificación de ADN con
una mayor sensibilidad que la medición de la absorbancia del ADN en sí. Además,
se pueden usar tintes específicos para poder teñir solo tipos específicos de ácido
nucleico como ADNds o ARN, aumentando así la especificidad de la cuantificación y
reduciendo el efecto de los contaminantes. Sin embargo, los métodos basados en la
fluorescencia en general son más costosos que los métodos asociados a la
absorbancia además de que a menudo necesitan la preparación de una curva
estándar. Para este tipo de medición es necesario la utilización de un lector de
microplacas o un fluorómetro de un solo tubo (Tsang, 2020).
● MÉTODOS BASADOS EN LA ELECTROFORESIS
En este método, se emplea un tinte fluorescente como bromuro de etidio o SYBR
Green al gel o las muestras, seguido de electroforesis de las muestras en paralelo a
una escalera de ADN y las bandas en el gel se visualizan con un transiluminador o
un sistema de documentación en gel. Las bandas de la escalera de ADN tienen una
masa conocida, por lo que la cantidad de ADN en nuestras muestras se puede
estimar comparando la intensidad de sus bandas con la de la escalera de masas. Si
bien el método es muy específico e ignora la mayoría de las impurezas, es lento,
inexacto y de baja sensibilidad (Tsang, 2020).
○ Electroforesis en gel de agarosa; si bien no es la forma más rápida de
cuantificación de ADN, sirve para no solo averiguar cuánto ADN se tiene sino
también para ver si el ADN está intacto o si tiene el tamaño adecuado. Estas
características le dan puntos extras frente a las técnicas de absorbancia.
Para esta técnica es necesario primero verter un gel que contenga un tinte
intercalador de ADN y elegir una escalera de ADN con concentraciones
conocidas. Luego, se procesan las muestras de ADN en diferentes diluciones
y se cuantifican en función de las intensidades de banda de ADN en relación
con la intensidad en la escalera (G.T.B.&.Co.Kg, 2021).
○ Electroforesis capilar; este método de cuantificación de ADN mediante es
similar a la cuantificación de ADN mediante electroforesis en gel. Excepto
que es más pequeño y automatizado. A diferencia de la electroforesis en gel,
solo necesita 1-2 μl de muestra y el tiempo de ejecución es de solo unos
minutos por muestra. Durante la ejecución, los fragmentos de ADN se
 mueven a través de un canal de micro o nano fluidos y las muestras se
separan por electroforesis. Los fragmentos más pequeños migran más rápido
que los más grandes. Estos fragmentos se cuantifican a lo largo del tiempo
utilizando un tinte fluorescente que se intercala en el ADN de manera que los
fragmentos más pequeños se cuantifican primero antes que los fragmentos
más grandes (G.T.B.&.Co.Kg, 2021).

2. ¿Por qué razón se varía la concentración de agarosa en la preparación de los geles?

y ¿qué objetivo tiene realizar recorridos a diferentes voltajes?
RESPUESTA: La concentración de agarosa en un gel varía debido a que esta dependerá
de los tamaños de los fragmentos de ADN a separar, con la mayoría de los geles que
oscilan entre 0.5% -2% (Lee et al., 2012).
Emplear recorridos a diferentes voltajes permite la separación de diferentes fragmentos de
ADN aumentando las distancias de los componentes fraccionados en el gel, revelando
pequeñas diferencias en la longitud de los diferentes componentes del ADN (Oliva et al.,
2008).

3. ¿Cuál es la función del bromuro de etidio? ¿Qué precauciones se deben tener con
este reactivo y por qué?
RESPUESTA: El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante (se intercala entre las
bases nitrogenadas) que se usa como colorante fluorescente para la visualización de ácidos
nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida. El BrEt absorbe luz ultravioleta de λ ≈ 300
nm, y emite una luz anaranjada de 590 nm, mediante la cual podemos observar la posición
y cantidad relativa del ADN en el gel tras la electroforesis (Cornejo Romero et al., 2014).
El bromuro de etidio es tóxico a elevadas concentraciones debido a su capacidad
mutagénica. Se debe evitar la inhalación del compuesto en estado sólido (manipularlo en
campana de extracción), y se deben manejar las soluciones siempre con guantes (Cornejo
Romero et al., 2014).

4. ¿Qué otras sustancias pueden absorber a 260 nm?

RESPUESTA: Los ácidos nucleicos absorben fuertemente la luz ultravioleta con longitudes
de onda de 260 nm debido a la estructura de resonancia de las bases de purina y pirimidina
(Olson & Morrow, 2012).

5. Explique la diferencia entre la cuantificación de ADN utilizando espectrofotómetro y

utilizando Nanodrop. Según su concepto, ¿cuál de las dos ofrece más ventajas y por
qué?
RESPUESTA: Entendiéndose como nanodrop al método de electroforesis capilar explicado
en el numeral 1, la mayor diferencia entre este y el espectrofotómetro radica en la cantidad
de muestra necesaria, para el espectofotómetro es necesaria una cantidad de muestra
mayor a la necesaria para un Nanodrop y es por esto, a mi concepto en dónde radica la
mayor ventaja del Nanodrop, eso y el hecho de que genera una especie de “gradiente” en la
cual los fragmentos más pequeños se cuantifican primero antes que los fragmentos más
grande.

REFERENCIAS
● G.T.B.&.Co.Kg. (2021). DNA quantification methods. Berthold Technologies.
https://www.berthold.com/en/bioanalytic/applications/dna-quantification/methods/
● Tsang, J. (2020). Quantifying DNA? Here are five DNA quantification methods to
consider. Addgene Blog. https://blog.addgene.org/five-methods-for-quantifying-dna
● Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., & Kim, Y. H. (2012). Agarose gel
electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized
Experiments, 62. https://doi.org/10.3791/3923.
● Oliva, D., di Maio, S., Sisino, G., Bellavia, D., & Barbieri, R. (2008). Increasing
voltage gradient electrophoresis of DNA. Journal of Chromatography A, 1187(1–2),
205–208. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2008.02.033.
● Cornejo Romero, A., Serrato Díaz, A., Rendón, B., & Rocha, M. (2014).
Electroforesis de ADN. En Herramientas moleculares aplicadas en ecología:
Aspectos teóricos y prácticos (1.a ed., pp. 27–51). Instituto Nacional de Ecología y
Cambio Climático.
● Olson, N. D., & Morrow, J. B. (2012). DNA extract characterization process for
microbial detection methods development and validation. BMC Research Notes, 5(1).
https://doi.org/10.1186/1756-0500-5-668
● E.D.T.A. ACIDO pro-an·lisis (ACS). (2006). Grupo Español IIC.
https://www.ge-iic.com/files/fichas%20productos/EDTA.pdf
● Ficha de datos de seguridad: EDTA. (2015). Carl Roth. https://bit.ly/3ySVRSU
● Ficha de datos de seguridad: TBE buffer. (2016). Carl Roth. https://bit.ly/3zVDk9R
● Ficha técnica: Tampon TBE. (2021). MerckMillipore.
https://www.merckmillipore.com/CO/es/product/TBE-buffer,MDA_CHEM-106177
● Ficha de datos de seguridad: Azul de bromofenol. (2021). Chem-Lab.
https://doc.chem-lab.be/MSDS?client=serviquimia&lang=SP&prodnr=CL070223
● Ficha de datos de seguridad: Azul de bromofenol. (2000). MerckMillipore.
https://bit.ly/3BIwVPY